摘要
自然界构成蛋白质的20种氨基酸中，除甘氨酸外其它19种氨基酸均具有D/L-两种立体构型。传统观念认为L-氨基酸是参与生命活动的主体，D-氨基酸在生物体内的存在及生理活性未被重视。食品作为D-氨基酸的重要来源，尤以发酵制品中D-氨基酸含量较高。近年来研究发现D-氨基酸可作为生理活性物质以及一些疾病的标记物，在机体生理及病理过程中发挥重要作用。然而目前关于D-氨基酸的功能研究尚不全面，其具体功能远远未被揭示，基于D-氨基酸与人体生理功能所具有的密切联系，探讨其功能与作用机制则成为一个值得关注的重要科学问题。本文旨在探究D-氨基酸在发酵乳制品中的含量与分布规律，并多维度分析其中高丰度D-氨基酸的生物活性。 首先基于高效液相色谱法（HPLC）测定了12种发酵与未发酵乳制品中游离D-氨基酸水平，经系统性对比发现发酵乳制品中D-Asp、D-Glu和D-Ala丰度更高。为进一步探究其中差异D-氨基酸的产生机制，以发酵乳制品中应用最为广泛的乳杆菌属和双歧杆菌属的六株乳酸菌（乳双歧杆菌（Bifidobacteriumlactis）M8、两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）BBi32、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）LP45、鼠李糖乳杆菌（LactobacillusrhamnosusGG）LRa05、短双歧杆菌（Bifidobacteriumbreve）207-1和副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）207-27）为代表，定量监测了各菌株在不同生长时期对三种D-氨基酸（D-Asp、D-Glu和D-Ala）的积累情况。结果表明，乳酸菌发酵是造成发酵乳制品中D-Asp、D-Glu和D-Ala丰度较高的重要原因；上述六株乳酸菌产D-氨基酸的种类和能力存在菌株特异性，未观察到在属间存在明显差异，六株乳酸菌均能产D-Ala，LP45、207-27、LGG以及207-1可同时产D-Glu和D-Asp。 为进一步研究D-Asp、D-Glu和D-Ala的生理活性，通过活细胞动态成像从细胞形态学和增殖能力两重维度探究了上述三种D-氨基酸对MC38细胞基本生长属性的影响。结果显示，在细胞形态学方面，D-Asp（10mM）干预使细胞面积显著减小，细胞形状因子显著增加；而D-Glu（10mM）和D-Ala（10mM）的干预使细胞面积均显著增加，细胞形状因子均显著降低。细胞形状因子越高指示细胞可能处于分裂的状态，进一步通过细胞增殖实验进行验证发现，D-Asp（10mM）干预确实可显著增加细胞数量和存活率，而D-Glu（10mM）和D-Ala（10mM）干预则呈相反结果，这与形态学结果相符。综上所述，本研究通过细胞形态学和增殖能力两个角度揭示了D-Asp具有促进细胞增殖的作用，而D-Glu和D-Ala则呈现抑制作用。 为进一步阐释D-Asp促进细胞增殖的潜在机制，借助mTORC1通路受抑制的细胞和动物模型进行探究。体外实验结果表明，在mTORC1通路受到抑制的细胞模型中，MC38细胞的增殖能力受到抑制。在此模型下进行D-Asp干预，细胞的增殖能力与模型组相比无显著性差异；结合第三章实验结果综合分析，mTORC1通路的抑制消除了D-Asp原本在正常细胞模型中表现出的促增殖作用，这揭示了D-Asp发挥促进细胞增殖的功能可能部分依赖于mTORC1通路。进一步在小鼠模型上验证发现，抑制mTORC1通路的模型组小鼠的肿瘤组织生长受阻；在此基础上进行D-Asp干预，结果表明小鼠的肿瘤组织生长及Ki-67表达量与模型组相比均无显著变化，这与细胞实验结果一致。总体而言，体外和体内实验结果相互印证，均验证了D-Asp发挥促进细胞增殖作用可能部分依赖于mTORC1通路。 综上所述，与未发酵乳制品相比，发酵乳制品的D氨基酸中以D-Asp、D-Ala和D-Glu相对丰度最高，乳酸菌发酵是造成其含量差异的重要原因。进一步探究这三种D-氨基酸的功能发现，D-Asp具有促进细胞增殖的作用，而D-Glu和D-Ala则呈现抑制作用。深入探究D-Asp发挥功能的机制揭示了其促进细胞增殖作用可能部分依赖于mTORC1通路。此研究为后续探索各类食品中D-氨基酸的分布特点与生理功能提供参考思路，并为调控发酵食品中D-氨基酸的产生提供基础。
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