摘要
单细胞转录组测序技术（Single-cell RNA-seq，scRNA-seq）可以在单细胞尺度下分析细胞内基因表达谱信息，是一类全新的探索单个细胞状态，解析细胞内部动态变化过程的有力工具。目前已经有大量用于构建单细胞RNA测序文库的方法，根据测序通量可分为两类，一类是基于微滴（Droplet）测序技术的inDrop和Microwell-seq可以获得高通量的单个细胞转录组测序信息，但此类方法获取的单个细胞转录组信息量较少。另一类以孔板为基础的测序技术，如Smartseq2和Cel-seq，这类方法虽然检测通量较低，但可以获得更为全面的单细胞转录组信息。 鉴于单细胞内RNA含量稀少，目前单细胞转录组建库技术常采用全转录组扩增技术提高单细胞转录组起始量，但由于RNA捕获或cDNA扩增时出现的偏差，以及UMI标记数据中低测序覆盖率的问题，从而无法获得单细胞转录池中低、中等表达丰度基因信息。其具体表现为单细胞转录组测序数据矩阵十分稀疏，出现大量0值。这种由于方法上的缺陷造成单细胞转录组测序数据 0 值，被称为技术性基因表达丢失（Technical Dropout）。稀疏的单细胞转录组表达矩阵严重影响了下游分析，故技术性基因表达缺失是目前单细胞转录组测序技术面临的一个难题。针对技术性基因表达缺失的问题，目前常采用降维的方式忽略丢失的基因，或是利用概率模型填补0值进行基因插补，这类通过计算的手段虽然能一定程度解决技术性基因表达缺失导致单细胞转录组表达矩阵稀疏的问题，但对于后续数据分析以及理解细胞状态可能造成偏差。 本研究首次在实验层面针对单细胞转录组测序中出现的Technical Dropout问题使用实验手段进行优化。利用NSR和oligo-dT序列捕获全长RNA信息，并在大规模扩增前对双链DNA进行片段化和标签化处理，通过此改进获得的均一化双链片段降低了片段捕获差异以及扩增偏差。我们将这个新的 scRNA-seq 技术命名为：scSTAT-seq （Streamlined Transcription And Tagmentation）。此方法可以大幅度减少技术性基因表达丢失，在单个细胞内获得平均 8000 个编码蛋白基因信息。高基因捕获率有助于研究细胞内部共表达基因信息，能够更全面的描述细胞状态。由于scSTAT-seq的实验过程均在原孔中进行，仅需少量试剂添加步骤便可在7h内完成建库流程，线性化的实验步骤为自动化建库方案提供操作基础。相较常用的单细胞转录组测序建库方法SMART-seq2， scSTAT-seq的建库步骤简单同时成本优势更加明显。 基于 scSTAT-seq 技术检测小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞向破骨细胞分化的关键时间节点。通过单细胞转录组数据分析，发现破骨细胞分化过程伴随着丰富的囊泡运动，其中Rab32参与的细胞内囊泡转运过程参与了破骨细胞分化。在此基础上，通过构建单核细胞Rab32条件性敲除小鼠（Rab32flox/flox;LysMCre），我们观察到Rab32缺失引发小鼠出现骨质疏松症，并验证其骨流失的原因是破骨细胞数量增加及活性增强导致的噬骨能力提高。通过CRISPR-Cas9 系统构建Rab32 敲除型细胞系以及体外破骨细胞分化培养体系，在细胞学水平重复了体内观察到Rab32缺失促进破骨细胞分化的结果。利用慢病毒体系构建Rab32及其活化（Q83L）和抑制型（T37N）突变体过表达细胞系，在细胞学水平发现过表达 Rab32 能够抑制破骨细胞分化进程且抑制过程与蛋白活化形式相关。通过Bulk RNA-seq分析Rab32缺失和过表达的细胞在破骨细胞分化关键节点的转录组信息变化，发现并验证了 Rab32 调控 DMT1 转运影响细胞内铁离子分布。破骨细胞内部铁离子转运异常，导致破骨细胞分化受到影响。 综上所述，本文首次在实验层面建立了针对单细胞转录组测序中技术性基因表达丢失问题的解决方案：scSTAT-seq。利用scSTAT-seq检测破骨细胞分化的关键节点，可以在更精细的尺度下探索细胞分化时细胞转录组信息变化过程，为骨质疏松等骨相关疾病的治疗奠定基础。
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