摘要
目的:嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫治疗是最具前景的癌症疗法之一，在治疗恶性血液肿瘤中已经取得了成功。但CAR-T疗法在实体瘤中的疗效普遍较差，表明现有治疗策略还有待优化与改良。常规CAR-T细胞在识别肿瘤抗原后通过CD3和经典共刺激分子CD28/41BB的信号结构域激活T细胞,杀伤肿瘤。但在肿瘤微环境中存在阻碍T细胞活化信号传导的免疫抑制机制，限制了其中的CAR-T细胞发挥足够的效应功能。因此，我们提出在CAR-T细胞中引入固有免疫信号分子元件，使其能在活化后激活Ⅰ型干扰素信号，获得更强的效应功能与抗肿瘤活性。 方法:根据对天然免疫信号传导机制的研究，我们将Ⅰ型干扰素信号上游的Toll样受体（TLR3/8）的信号传导元件（TIR模块）融合到CAR分子的胞内信号结构域中。然而带有TIR信号模块的CAR分子不能有效地表达在细胞膜上。因此我们聚焦在TLR3下游的接头蛋白TRIF上。根据TRIF蛋白不同的结构域及其功能，我们将TRIF蛋白的154-389aa片段引入到CAR分子的胞内信号结构域中。使用流式细胞仪确认了带有TRIF结构域的CAR分子能成功表达以及其体外的效应功能，并通过Western blot验证下游信号分子的激活。另一方面，虽然我们已经对CAR分子的信号结构域进行优化改造，但是我们对于CAR分子激活后的信号传导机制了解甚少。为此，我们构建了超高分辨显微镜成像平台，实现了在接近单分子分辨率条件下观测CAR分子活化后与其他蛋白的互作关系。 结果:由于引入TIR3和8信号模块的CAR分子表达不佳,我们设计了 TRIF-CAR。初步的体外实验结果表明TRIF-CAR具有激活天然免疫信号的能力，并且TRIF-CAR-T细胞展现了更好的肿瘤杀伤功能。而利用超分辨成像技术，我们发现CAR-T细胞激活形成非经典的免疫突触。此外这种非经典的免疫突触有着区别于常规T细胞TCR信号激活后形成的突触结构，LCK分子随机分布在其中。 结论:我们仍需对现有的TRIF-CAR分子设计进行进一步优化，提升其表达并通过体内肿瘤模型进一步确认TRIF-CAR-T的抗肿瘤功能，以克服CAR-T细胞在实体瘤中信号功能被抑制的困境。在CAR分子信号机制方面的研究，后续将继续研究常规TCR信号中重要的信号传递分子，尝试解析CAR-T细胞中CAR分子激活后的信号传导机制，为CAR分子的优化改造提供重要的理论基础。
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