摘要
目的: 结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一,其发病率和死亡率分别居于第三位及第二位。研究统计，2023年约有153020人将被诊断为CRC,其中约52550人将死于该疾病。通常发达国家结直肠癌发病率较高，但近年来，包括我国在内的发展中国家的结直肠癌发病率也呈现出持续上升的趋势。因此，大量结直肠癌病例对全球公共卫生构成日益严峻的挑战。研究发现，转移是导致结直肠癌高复发率和低生存率的主要因素。尽管近年来在诊断和全身治疗方面都取得了较大进展，但结直肠癌的局部或全身复发以及晚期远端器官转移患者的预后仍然很差，这些仍是临床上未解决的难题。因此，应进一步明确结直肠癌发生发展以及转移的分子机制，以便制定具体的治疗策略，为开发新的结直肠癌疗法提供巨大的机会。 LIM 和 SH3 结构域蛋白 1(LIM and SH3 protein 1,LASP1)是 LIM 和SH3蛋白家族成员之一，定位于染色体17q11-21.3上。作为一种特异性黏附蛋白，LASP1同时也是肌动蛋白结合蛋白的星云家族成员，最早在乳腺癌患者转移性腋窝淋巴结中发现。研究指出LASP1在动态调节肌动蛋白为基础的细胞骨架活动中起重要作用，同时发现激动剂依赖性的LASP1磷酸化水平变化也可能会影响肌动蛋白相关的离子运输活动。作为一种蛋白质编码基因，LASP1被发现在肿瘤组织中普遍高表达，其中包括转移性乳腺癌，肺癌，结直肠癌以及食管癌等。研究已经证实LASP1对于结直肠癌的发生发展至关重要，尤其是在转移性CRC中，但其机制尚不清楚。因此，在本研究中我们通过将临床与基础实验相结合旨在分析LASP1在人CRC组织及细胞中的表达情况，同时通过体内及体外实验明确LASP1在人CRC中的作用，并阐明LASP1促进入CRC发生发展的机制，最终为探索人CRC的新生物学靶标给予理论支持。 方法: 1. 研究LASP1在人CRC组织和细胞中的表达。 (1)数据库分析:通过GEPIA数据库分析检索LASP1在各种肿瘤中的表达情况，并将其在正常结直肠上皮及CRC中的表达进一步进行比较。 (2)Western blot实验检测人CRC细胞中LASP1的表达水平;免疫组织化学法检测人CRC芯片中LASP1的表达情况。 2.明确LASP1在人结直肠癌中的作用。 (1)细胞系来源的异种移植瘤小鼠模型(CDX)的构建:小鼠皮下注射稳定敲低LASP1的结直肠癌DLD1细胞系，连续监测，观察LASP1对细胞来源的小鼠移植瘤成瘤能力的影响。 (2)体外实验 a.研究LASP1表达水平对于结直肠癌细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响。 通过CCK8实验，平板克隆实验，Transwell实验及伤口愈合实验来检测LASP1对结直肠癌表型的影响。 b.探索LASP1影响CRC细胞生长及转移能力的分子机制。 通过Western blot实验及免疫组织化学法检测LASP1对CRC细胞及组织中EMT相关标志物表达水平的影响。 3. 探索LASP1促进入CRC进展的具体机制。 (1)通过pull down实验及液相质谱技术筛选出与LASP1潜在结合的互作蛋白，并通过免疫共沉淀实验进一步验证其相互作用。 (2)确定LASP1与AP1M2之间的关系。通过Western blot实验及qRT-PCR实验检测LASP1是否影响AP1M2表达水平，并确认这种影响发生在转录或翻译水平。 4. 研究AP1M2在人CRC中的表达情况并探索其在CRC中的作用。 (1)通过数据库分析，Western blot实验及免疫组织化学检测AP1M2在人正常结肠上皮及人CRC细胞和组织中的表达水平。 (2)通过CCK8实验，平板克隆形成实验，Transwell实验及伤口愈合实验研究AP1M2对CRC细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响。 (3)利用CDX模型，在小鼠皮下注射稳定敲低AP1M2的结直肠癌DLD1细胞系，连续监测，观察AP1M2对细胞来源的小鼠移植瘤成瘤能力的影响。 5.设计Resue实验确认CRC中LASP1与AP1M2之间的上下游关系。 6.确定LASP1影响AP1M2蛋白稳定性的具体机制。 (1)在CRC细胞中，通过Western blot实验检测加入CHX后AP1M2的表达水平。同时在加入CHX的同时加入泛素-蛋白酶体途径抑制剂MG132或溶酶体途径抑制剂氯喹，判断LASP1是通过泛素-蛋白酶体途径或溶酶体途径影响AP1M2的降解。 (2)通过体外泛素化实验检测LASP1对AP1M2泛素水平的影响。 7. 筛选与AP1M2相互作用的E3泛素连接酶。 通过UbiBrowser网站筛选出与AP1M2潜在结合的E3泛素连接酶,GEPIA网站预测其相关性，并通过免疫共沉淀确认其相互作用。通过体外泛素化实验确认E3泛素连接酶SMURF1可以影响AP1M2的泛素水平。 8.探索蛋白LASP1,AP1M2,SMURF1之间结合的具体区域及潜在关系。 (1)通过竞争性免疫共沉淀实验确认是否LASP1与SMURF1竞争性结合AP1M2。 (2)设计AP1M2截短片段，研究AP1M2分别与LASP1或SMURF1的结合区域。 结果: 1.与人正常结肠上皮细胞及癌旁组织相比，LASP1在人CRC细胞和组织中均表达上调。 2.在体外下调LASP1的表达水平可显著抑制CRC细胞的增殖，克隆形成,迁移以及侵袭能力。在体内LASP1表达水平下调可抑制CRC细胞的小鼠皮下成瘤能力。同样，上调LASP1表达水平也可显著增强CRC细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。LASP1表达下调可显著影响CRC细胞中EMT相关标志物(E-cadherin、N-cadherin 以及 Vimentin)的表达水平。 3.通过pull down,质谱及免疫共沉淀实验得出AP1 M2为LASP1的互作蛋白。LASP1可影响AP1M2的蛋白水平，对AP1M2的mRNA水平没有影响。 4. 与正常结直肠上皮相比AP1M2在结直肠癌中表达显著升高。在体外，下调AP1M2的表达水平可显著抑制CRC细胞的增殖、克隆形成、迁移以及侵袭能力。同样，上调AP1M2表达水平也可显著增强CRC细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。AP1M2表达下调可显著影响CRC细胞中EMT相关标志物（E-cadherin、N-cadherin以及Vimentin）的表达水平。在体内，LASP1表达水平下调可抑制CRC细胞的小鼠皮下成瘤能力。 5.通过Resue实验说明AP1M2为LASP1在结直肠癌中发挥功能的主要下游分子。 6. LASP1表达下调可促进AP1M2的降解，并且这一影响主要通过泛素-蛋白酶体途径实现。LASP1可通过影响AP1M2的泛素化水平从而影响AP1M2的降解。 7 E3泛素连接酶SMURF 1可以与AP1M2结合，并影响AP1M2的泛素化水平。 8. LASP1和SMURF1可以与AP1M2竞争性结合,并确认其结合区域为AP1M2 的 1-168aa 区域。 结论: LASP1是结直肠癌的一个重要促癌因子，其高表达与患者的不良预后相关。LASP1可通过与E3泛素连接酶SMURF1竞争性结合AP1M2,抑制AP1M2的降解，进而促进结直肠癌的进展。因此，靶向LASP1和AP1M2有望为结直肠癌的治疗提供新的理论依据。
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