摘要
骨肉瘤（osteosarcoma, OS）是原发于骨骼系统的恶性肿瘤，手术切除、化疗、新辅助化疗等治疗手段虽然能不同程度抑制骨肉瘤的发生发展，但是存在复发和转移的可能。中药复方具有多成分、多靶点、多通路的优势，避免了单一靶点治疗产生的耐药性，且能减轻化疗药物引起的不良反应，但其作用机制较为复杂。本文针对依据国医大师刘柏龄教授的骨质增生丸所得的鹿茸补肾方，研究其对骨肉瘤细胞的抑制作用。 首先使用Meta分析系统探讨了单独中医药或联合化疗治疗骨肉瘤的安全性及有效性，然后收集不同煎煮次数的鹿茸补肾方滤液，检测其中蛋白质、多糖、干膏含量及对细胞增殖的抑制能力，优化组方的煎煮条件。优化后的补肾方制成冻干粉作用于骨肉瘤细胞通过细胞划痕、Western Blotting、Transwell、ELISA等实验探究其对骨肉瘤细胞的抑制作用。进一步通过网络药理学分析鹿茸补肾方影响骨肉瘤细胞迁移和侵袭的信号通路，并采用Western Blotting、细胞划痕、Transwell等实验进行验证，深入探讨PI3K-AKT信号通路，探究中药复方鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞的影响。 实验结果表明，与单独化疗相比，单独中医药或联合化疗治疗骨肉瘤具有更高的安全性及有效性；煎煮四次的鹿茸补肾方可以得到较多的有效成分，且对骨肉瘤细胞有抑制作用；不同浓度的鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞的抑制作用可以随时间和浓度的增加而效果更为明显，鹿茸补肾方冻干粉抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力，对U2OS细胞中的肿瘤坏死因子TNF-α、肿瘤坏死执行因子MLKL的表达有促进作用，且影响凋亡相关因子BCL-2与BAX的表达。网络药理学筛选得到鹿茸补肾方活性成分68个，对应靶点1668个，疾病靶点458个，最终得到药物与疾病交集靶点21个，筛选得到关键靶点7个；对鹿茸补肾方治疗骨肉瘤的关键靶点进行富集分析发现PI3K-AKT信号通路可能为鹿茸补肾方调控骨肉瘤细胞迁移侵袭等行为的关键信号通路；鹿茸补肾方冻干粉作用于骨肉瘤细胞后，PI3K-AKT信号通路中关键因子PI3K、AKT、p-AKT的表达下调，且PI3K抑制剂和鹿茸补肾方冻干粉联合作用对骨肉瘤细胞迁移侵袭能力的抑制作用更为显著。 以上结果表明鹿茸补肾方对骨肉瘤细胞增殖、转移能力有抑制作用，对细胞凋亡有促进作用，发挥作用的主要途径可能为PI3K-AKT信号通路。本文初步揭示了鹿茸补肾方调控骨肉瘤细胞转移的作用机制，可以为传统中药复方在骨肉瘤的临床治疗应用提供一定的实验基础和理论支撑。
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