摘要
为了比较饲料中菜粕和发酵菜粕对凡纳滨对虾饲料中鱼粉的替代效果，探索抗营养因子次级代谢产物异硫氰酸酯的作用及功能，在本研究中，通过考察不同含量的菜粕、降低异硫氰酸酯的发酵菜粕替代鱼粉及饲料中添加丙烯基异硫氰酸酯对凡纳滨对虾生长、消化、营养物质沉积、肝胰腺健康和免疫的影响，确定菜粕、发酵菜粕及异硫氰酸酯在凡纳滨对虾饲料中使用的具体作用。此外，为进一步了解实际养殖中饲料异硫氰酸酯对生长的影响，本文还研究了菜粕和以异硫氰酸酯含量降低为主要特征的发酵菜粕替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺代谢的影响，通过代谢组学分析，剖析饲料中菜粕或发酵菜粕影响凡纳滨对虾生长的代谢机制。 1.菜粕、发酵菜粕及异硫氰酸酯对凡纳滨对虾生长性能、消化能力及营养成分沉积的影响 为了研究饲料中菜粕、发酵菜粕替代鱼粉及抗营养因子代谢产物异硫氰酸酯对凡纳滨对虾生长性能、消化能力及营养成分沉积的影响，本实验除对照组外，设计4组菜粕组，分别以5%(R5)、10%(R10)、15%(R15)和20%(R20)的菜粕替代鱼粉，另设计4组发酵菜粕组分别以5%(F5)、10%(F10)、15%(F15)和20%(F20)的发酵菜粕替代鱼粉；为解析异硫氰酸酯是否影响菜粕对鱼粉的替代效果，设置2组异硫氰酸酯(ITC)半纯化饲料(I10和I20)，其中异硫氰酸酯含量(51.7mg/kg和103.4mg/kg)分别与R10和R20相同。以上述11组等氮等能(CP41%，GE17MJ/Kg)的饲料饲喂初始平均体重为(3.0±0.3)g的凡纳滨滨对虾8周。结果显示：(1)在本实验条件下，20%以内菜粕替代鱼粉会降低对虾饲料系数、蛋白表观消化率和脂肪酶活力(P＜0.05)，对肌肉总氨基酸含量无显著性影响。10%菜粕可以维持对虾肝胰腺正常形态，超过10%菜粕会降低肌肉蛋白含量(P＜0.05)。15%菜粕不影响凡纳滨对虾增重率，可以提高虾壳Ca、P含量，提高胰蛋白酶活性(P＜0.05)。(2)15%发酵菜粕使用量能够降低饲料系数，相对于菜粕未显著提高生长、营养成分和肝胰腺形态等指标，降低了蛋白表观消化率和脂肪酶活性(P＜0.05)。(3)单独添加≤103.4mg/kg的丙烯基异硫氰酸酯，与对照组和相应菜粕组相比，对凡纳滨对虾的生长和肝胰腺组织形态无显著影响；降低了脂肪酶活性(P＜0.05)。相较于菜粕组，单独添加丙烯基异硫氰酸酯提高了蛋白表观消化率、对虾肌肉蛋白含量，有利于对虾蛋氨酸的沉积(P＜0.05)。 上述结果表明，15%菜粕替代鱼粉不影响凡纳滨对虾正常生长，能够提高蛋白消化利用，但会影响饲料摄食及脂肪吸收。降低异硫氰酸酯后的发酵菜粕较菜粕对生长无显著影响，能够提高饲料利用率和蛋白消化，但会进一步降低脂肪消化能力。推测菜粕中的异硫氰酸酯也可能如单独添加的异硫氰酸酯一样有利于凡纳滨对虾蛋白沉积和脂肪代谢，为异硫氰酸酯在水产动物上的利用提供新思路，有关推论需要进一步验证。 2.菜粕、发酵菜粕及异硫氰酸酯对凡纳滨对虾生化指标、甲状腺激素、抗氧化能力、免疫能力及肝肠健康相关基因表达的影响 为考察菜粕、发酵菜粕及异硫氰酸酯对凡纳滨对虾生化指标、甲状腺激素、抗氧化能力、免疫能力及肝肠健康相关基因表达的影响，在前一章养殖实验结束后，对凡纳滨对虾的生化、抗氧化、免疫、肝肠健康相关指标进行测定。结果显示：(1)饲料中低于20%的菜粕使用量会使凡纳滨对虾血清TP、ALB、血氨、尿素氮降低(P＜0.05)；血清T-AOC升高，MDA降低(P＜0.05)；肝胰腺T-AOC，SOD降低；CYP4V18基因上调(P＜0.05)；不影响对虾免疫水平，提高了氮利用率、对虾血清抗氧化能力，利于对虾蜕壳；但降低了蛋白吸收能力、肝胰腺抗氧化水平及能量吸收。(2)5%发酵菜粕组血清蛋白增高，血氨降低，TG、TC含量升高等(P＜0.05)，显著改善了对虾抗氧化能力和肝胰腺健康。对虾血清C3，C4浓度增高，肠道基因MyD88、TRAF6和TGF-β1等抗炎因子的下调，表明发酵菜粕提高了凡纳滨对虾免疫水平。20%发酵菜粕使用时凡纳滨对虾的生长抑制和肝胰腺受损，表现在白蛋白降低，血氨升高不利于对虾蛋白质沉积；T-AOC、GPx降低，抗氧化能力减弱。(3)饲料中添加低于51.7mg/kg的丙烯基异硫氰酸酯对凡纳滨对虾机体氮的转化及脂肪代谢有负面影响，较相应菜粕组血清蛋白、甘油三酯和胆固醇均有提高，推测菜粕中的异硫氰酸酯会与其他物质有交互作用进一步影响对虾蛋白、脂肪代谢；添加低于103.4mg/kg的丙烯基异硫氰酸酯能够提高血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、C3和C4，提高了对虾抗氧化能力和非特异性免疫能力。 3.基于代谢组学研究菜粕和发酵菜粕对凡纳滨对虾生长和肝胰腺健康的作用机制 基于第1章和第2章的生长性能和肝胰腺健康结果，进一步运用LC-MS代谢组学方法对对照组、R15组和F15组凡纳滨对虾肝胰腺代谢物进行分析，探究菜粕和发酵菜粕对凡纳滨对虾影响的机制，通过F15和R15组对比侧面了解菜粕中抗营养因子异硫氰酸酯对凡纳滨对虾肝胰腺代谢的影响。结果显示：(1)与对照组比，R15组凡纳滨对虾肝胰腺中的差异代谢物有898种，其中注释到KEGG数据库中的差异代谢物有39种，上调代谢物7种，下调代谢物32种。参与的代谢通路差异显著(P＜0.05)的有12条，为一碳叶酸代谢、嘌呤代谢、氨酰基-tRNA生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、FoxO信号通路、花生四烯酸代谢、嘧啶代谢、组氨酸代谢、丙氨酸amp;天冬氨酸和谷氨酸代谢、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。(2)F15与control组比，F15组凡纳滨对虾肝胰腺中的差异代谢物有1141种，其中注释到KEGG数据库中的差异代谢物有50种，上调代谢物15种，下调代谢物35种。参与的代谢通路差异显著(P＜0.05)的有8条，分别为嘌呤代谢、嘧啶代谢、氨酰基?tRNA生物合成、丙氨酸amp;天冬氨酸和谷氨酸代谢、FoxO信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢和D-谷氨酰胺amp;D-谷氨酸代谢。(3)F15组与R15组比，F15组凡纳滨对虾肝胰腺中的差异代谢物有994种，其中注释到KEGG数据库中的差异代谢物有50种，上调代谢物23种，下调代谢物27种。参与的代谢通路差异显著(P＜0.05)的有11条，分别为嘌呤代谢、氨酰基?tRNA生物合成、嘧啶代谢、丙氨酸＆天冬氨酸和谷氨酸代谢、组氨酸代谢、FoxO信号通路、甘油磷脂代谢、一碳叶酸代谢、ABC转运蛋白、甘氨酸amp;丝氨酸和苏氨酸代谢和D-谷氨酰胺＆D-谷氨酸代谢。 上述结果表明，饲料中15%菜粕替代鱼粉对凡纳滨对虾代谢有显著影响，从代谢层面促进对虾生长发育，增强对虾机体对氨基酸等营养物的吸收与利用，但相对降低对虾肌肉鲜味。促进脂肪代谢，降低肝胰腺脂肪蓄积，提高对虾抗炎作用，保护对虾肝胰腺健康。降低异硫氰酸酯的发酵菜粕替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺代谢也有显著影响。15%发酵菜粕比15%菜粕更利于促进对虾生长发育和蛋白吸收，但降低了神经信号传导功能和脂质代谢，不利于凡纳滨对虾肝胰腺健康。推测15%菜粕中所含的异硫氰酸酯对凡纳滨对虾的肝胰腺健康有益，具体功能机制有待进一步验证。
NETL