摘要
目的: 1.验证痒觉受体MRGPRX1为特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)的靶点，为开发治疗特应性皮炎的药物提供新的思路。 2.利用单颗粒冷冻电镜技术解析在海洋中药芋螺(Conus)分泌的生物毒素CNF-Tx2作用下MRGPRX1与G蛋白三聚体复合物结构。解析痒觉受体MRGPRX1的作用机制并找到CNF-Tx2致痒的关键氨基酸，利用结构生物学技术改造短肽使成为偏好性配体药物。 3.结合结构与生化数据，筛选出具有Arrestin偏好性的突变短肽，并通过动物实验测试偏好性配体药物的有效性和安全性,为开发靶向MRGPRX1治疗特应性皮炎的药物提供科学依据。 方法: 1.利用shedding实验验证MRGPRX1为特应性皮炎的新型靶点。收集特应性皮炎病人和正常人的临床样本，并创新性地开发针对病人血液来检测靶点活力的评估方法。 2.利用单颗粒冷冻电镜技术解析在芋螺毒素CNF-Tx2作用下，MRGPRX1与G蛋白三聚体复合物结构。利用BactoBac杆状病毒表达系统制备BRI1-MRGPRX1、DNGαi1、Gβ1/Gγ2、scFv的病毒，在昆虫细胞表达系统中表达BRIL-MRGPRX1、DNGαi1、Gβ1/Gγ2、scFv蛋白，在体外重组CNF-Tx2-MRGPRX1-Gαi复合物。利用冷冻电镜收集电镜数据，解析复合物高分辨率结构。 3.结构与生化数据相结合，筛选靶向MRGPRX1-Arrestin信号途径的偏好性配体。在HEK293细胞中过表达MRGPRX1、Rluc8-Gαi1、GB3、GFP2-Gγ9、MRGPRX1-EYFP、β-arrestin2-Rluc质粒，利用生物发光共振能量转移(BioluminescenseResonanceEnergyTransfer,BRET)技术验证CNF-Tx2野生型(WildType,WT)及其突变体对MRGPRX1的Gαi、Arrestin信号的激活能力。利用G蛋白解离实验和β-arrestin招募实验得到相应的EC50值和Emax值，通过公式计算β值，验证突变体的偏好性。 4.通过C57BL/6J小鼠建立氯喹(Chloroquine,CQ)致痒模型以及特应性皮炎小鼠模型，检验筛出的偏好性短肽的有效性和安全性。氯喹致痒模型为皮下注射氯喹,给予偏好性药物治疗，通过小鼠抓挠次数量化抓挠行为，检验药物的止痒效果。特应性皮炎小鼠模型检验指标为小鼠抓挠次数(一回合抓挠被定义为后爪在注射部位定向的连续抓挠运动。使用两个前爪被归类为梳理行为，不算在内)，对小鼠耳部皮损处炎症严重程度进行评分等，通过这些指标判断偏好性药物对特应性皮炎的治疗效果。 结果: 1.利用shedding实验验证了MRGPRX1为特应性皮炎的新型靶点。 2.解析了在芋螺毒素CNF-Tx2作用下MRGPRX1与下游G蛋白复合物物的高分辨率结构，整体分辨率为2.8A。 3.发现芋螺毒素CNF-Tx2的第十七位氨基酸是激活痒觉受体MRGPRX1的关键氨基酸。 4.证明了芋螺毒素CNF-Tx2能通过β-arrestin2介导MRGPRX1的脱敏。 5.在芋螺毒素CNF-Tx2基础上改造的突变体CNF-R17A、CNF-R17F、CNF-R17T具有很强的β-arrestin2偏好性，而且几乎不激活Gαi信号。 6.在动物模型上取得理想结果，证实了本课题筛选出的偏好性药物的止痒效果以及靶向痒觉受体MRGPRX1开发出治疗特应性皮炎的药物。 结论: 1.MRGPRX1为特应性皮炎的新型靶点。 2.在芋螺毒素CNF-Tx2基础上改造的突变体CNF-R17A、CNF-R17F、CNF-R17T具有很强的P-arrestin2偏好性，可作为靶向痒觉受体MRGPRX1治疗特应性皮炎的药物。
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