摘要
草鱼（CtenopharyngodonIdella）作为饮食生活中常见的水产品，2020年产量占全国淡水养殖总产出的21%。然而草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus,GCRV）引起的草鱼出血病对草鱼养殖产业的健康发展造成了巨大的损失与威胁。由于GCRV种类多样，已有的疫苗或抗病毒药物无法全面防治GCRV造成的危害。因此对不同基因型的GCRV基因编码及蛋白功能的研究十分必要。目前对GCRV的研究主要面向Ⅰ型与Ⅱ型，对Ⅲ型GCRV的复制机理了解相对较少，而对其S9序列编码的VP39蛋白的功能仍然未知。本研究将分别利用多种生物技术对VP39蛋白的生物学功能进行初步探究。主要包括以下三部分： 1.VP39蛋白生物信息学分析并制备多克隆抗体 我们用生物信息学的方法对VP39蛋白基本理化性质进行分析，发现VP39是一个大小为39.19KDa的亲水蛋白质，不具有信号肽和跨膜结构。VP39蛋白的脂肪指数为91.19，不稳定性指数为39.69，将其认定为稳定蛋白，预测细胞培养条件下的半衰期为30小时。 VP39蛋白的二级结构由39.27%的α螺旋，4.52%的β转角和42.37%的无规则卷曲构成，其余13.84%被预测为延伸链。此外，预测结果显示VP39蛋白具有20个丝氨酸磷酸化位点，15个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点。 我们通过PCR技术对VP39基因进行克隆，并构建重组质粒pET28a-VP39；利用原核表达的方法将重组质粒转入BL21感受态细胞中，诱导并纯化出大量目标融合蛋白；获得的蛋白溶液免疫小鼠以制备VP39多克隆抗体，并对所得多抗进行鉴定。菌落PCR结果表明pET28a-VP39质粒构建成功，测序结果正确。SDS-PAGE结果显示VP39大小约39KDa，可溶于PBS，这与预测的结果一致。WesternBlot分析表明所制备的VP39多抗既能识别HIS-VP39融合蛋白，也能精准识别GCRV感染细胞中的VP39蛋白，而不能识别未感染病毒的CIK细胞，具有良好的特异性，同时VP39多抗在被稀释10000倍的条件下依然保持有效检测能力。此外，qPCR和WesternBlot结果表明VP39在病毒侵染过程中表达量不断提高。VP39多克隆抗体的制备可用于GCRV-104的病原检测与诊断，同时也为进一步研究VP39的生物学功能打下基础。 2.VP39蛋白的生物学分析 利用蔗糖密度梯度离心法对GCRV-104病毒进行浓缩纯化，离心后的GCRV-104病毒在40%与50%的蔗糖浓度之间被富集。通过透射电镜可观察到大量完整的病毒粒子；为了对VP39蛋白的结构类型进行鉴定，我们通过WesternBlot进行分析，结果表明VP39是一个结构蛋白，组成了GCRVB-104衣壳的一部分，同时也证实了已有文献中VP38作为结构蛋白，而VP15作为非结构蛋白的预测；DotBlot分析结果进一步鉴定VP39是一个外衣壳蛋白，而VP39抗体中和病毒实验也同样证实了这一点，VP39多抗与GCRV-104病毒孵育后有效降低了病毒的复制水平，且呈剂量依赖性。通过IFA检测和细胞转染鉴定，我们确认VP39蛋白定位在细胞质中。此外我们对GCRV其中三种蛋白进行表达动态分析，结果显示VP38和VP39均在感染中期表达，后期表达量不断增加。但不同的是VP39在相同时间的表达量远低于VP38，这可能暗示尽管同为外衣壳蛋白，但二者在病毒侵染过程中发挥的完全不同的功能。分析结果同样显示非结构蛋白VP15在病毒感染前期表达，且呈现出表达量先上升后下降的趋势。 我们上调了VP39在GCO细胞中的表达量并感染病毒，结果表明与对照组相比，GCRV的复制水平被提高了。这也进一步证明VP39蛋白在病毒复制过程中发挥了重要的作用。 3.VP39蛋白互作多肽的筛选及分析 利用噬菌体展示技术筛选出VP39蛋白的结合多肽N''-APRLSHHIAHHH-C''，DotBlot分析进一步验证了蛋白与多肽之间的相互作用。为了发掘筛选多肽的作用，我们用不同浓度的多肽处理细胞并感染病毒，以观察其对病毒复制的影响。qPCR结果表明多肽处理细胞后，GCRV的复制水平显著上升。然而实验中我们忽略了pH对病毒侵染过程的影响，随着多肽浓度的提升，培养液的pH值也被下调。为此，我们利用HCl下调pH作为对照组，实验组多肽孵育细胞同时用NaOH中和pH值，结果显示pH下调确实促进了病毒的复制，而中和了pH的多肽溶液并不能对病毒复制造成影响。尽管如此，我们在NCBI上草鱼基因文库中筛选了与VP39蛋白存在潜在互作的4个多肽同源基因，分别为维甲酸诱导蛋白I（retinoicacidinducibleproteinI），雌激素受体α（estrogenreceptor-alpha），toll样受体18（Toll-likereceptor18）以及C-X-C基序趋化因子受体（C-X-Cmotifchemokinereceptor3.1）。这将为GCRV-104病毒在宿主内复制机制的深入探究拓展了新的视角。
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