摘要
副溶血弧菌是一种常见的食源性病原菌，对水产养殖业以及公共卫生安全造成严重的威胁。近年来，由抗生素所引起的细菌耐药性给防治副溶血弧菌感染带来新的挑战。噬菌体及其编码的裂解酶在抑菌方面显示出独特的优势，有望成为新型的抗生素替代品来解决细菌耐药性问题。基于此，本论文以副溶血弧菌噬菌体和裂解酶为研究对象，探究其生物学性质以及抑菌方面的应用潜力。研究的主要内容如下： （1）对水产养殖环境分离的副溶血弧菌VP20进行抗生素耐药性分析，结果显示VP20对头孢菌素类、四环素类、大环内酯类等14种抗生素具有耐药性。以该菌为宿主菌通过双层平板法分离得到一株裂解性噬菌体，命名为vB_VpaM_VPs20（后续简称VPs20）。噬菌体VPs20在双层平板上产生带有晕环的噬菌斑，透射电镜观察到其形态为肌尾噬菌体，由一个直径约60nm的多面体头部和长约140nm的可收缩尾部组成。宿主谱测定结果显示，VPs20仅对宿主菌VP20产生裂解效果。其最佳感染复数为0.001。一步生长曲线结果表明它的潜伏期约为20min，爆发期约为80min，裂解量约为56PFU/cell。噬菌体温度和pH敏感性实验结果表明，VPs20的温度耐受阈值约为50℃，pH耐受范围为5-9。体外抑菌实验结果表明，VPs20在不同MOI下都能抑制细菌的生长，但在抑制过程中会对噬菌体产生抗性。噬菌体清除生物被膜实验结果表明，VPs20处理已经成熟的生物被膜6h后，生物被膜量减少33.3%左右。 （2）对噬菌体VPs20进行全基因组测序和分析，结果表明VPs20的遗传物质为双链环状DNA，序列全长为53,793bp，G+C含量为45.03%，预测出70个ORFs，其中有24个编码已知功能蛋白。VPs20的基因组不编码tRNA，也没有抗生素耐药性基因以及毒力基因。通过Blast比对分析发现，VPs20的基因组新颖。根据保守蛋白末端酶大亚基和DNA聚合酶的系统发育分析显示，VPs20可能属于Chaseviridae科Nefertitivirinae亚科成员。 （3）噬菌体VPs20基因组中的ORF69编码一种裂解酶，将其命名为Lys69。成功构建表达载体pCzn1-Lys69，并在大肠杆菌ArcticExpress中进行诱导表达。在15℃、0.2mmol/LIPTG条件下诱导16h，裂解酶Lys69呈包涵体形式表达，通过变复性处理和亲和层析得到纯化的裂解酶Lys69。测定Lys69的抑菌活性以及对噬菌体抗性突变株和生物被膜的作用效果。结果表明，Lys69（0.8mg/mL）处理1h能够降低副溶血弧菌VP20约6lg单位的细胞数量，并对所试的8株革兰氏阴性菌均产生裂解效果。Lys69可以有效抑制噬菌体抗性突变株VP20R的生长，处理已经成熟的生物被膜1h后，生物被膜量减少约40%。生物信息学分析结果表明Lys69由123个氨基酸组成，蛋白分子大小约14.2kDa，等电点为8.88，氨基酸序列中不含信号肽以及跨膜区结构，保守结构域为PeptidaseM15家族成员。通过SWISS-MODEL构建三维同源结构模型并进行可视化分析，发现其表面分布带正电荷氨基酸，可能在其穿透细菌外膜过程中发挥作用。 综上所述，本研究分离副溶血弧菌噬菌体并从分子方面研究噬菌体编码的裂解酶，旨在为噬菌体以及裂解酶防治副溶血弧菌感染提供理论依据和研究基础。
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