摘要
目的: 增生性瘢痕（HS）是烧伤科、整形科和皮肤科常见的一种创面愈合障碍导致的病理性瘢痕。疼痛、瘙痒、毁容等症状强烈损害了患者的身心健康。HS的形成涉及许多病理过程，如成纤维细胞凋亡减少、胶原沉积过多、过度的血管生成等。目前临床上采用的疗法多针对单一病理过程，效果有限，复发率较高，且伴随许多副作用。天然产物是来源于动植物或昆虫、海洋生物和微生物的各种化合物，种类繁多且具有非常丰富的生物活性。由于其来源丰富和多样的生物活性，为针对多病理过程防治HS提供了潜在的解决方案。此外，微针（Microneedle,MN）系统能够大大增加药物的传递效率，还具有无痛、使用便捷等优点。并且已经有研究报道微针本身就能够通过机械途径有效缓解HS的形成。因次，本研究旨在探索三种天然产物对HS的防治效果及潜在机制，包括原儿茶醛(Protocatechuicaldehyde，PA)，大黄酚(Chrysophanol,CHR)和迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)。然后将最优的候选物进一步负载到可溶性微针中，并使用兔耳HS模型在体内探索其抗瘢痕形成的效果及潜在机制。 方法： 1.PA粉末溶于水、CHR/RA粉末溶于DMSO配制成一定浓度的溶液用于体外抗瘢痕实验。 2.增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophicscar-derivedfibroblasts,HSF)和人正常成纤维细胞(Humannormalfibroblasts,HDF)与不同浓度的PA/CHR/RA溶液在96孔板共培养48h，利用CCK-8试剂盒检测PA/CHR/RA对HSF的细胞活力的影响和对HDF的细胞毒性。使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）检测PA诱导HSF凋亡的情况，天狼星红染色检测HSF的胶原分泌总量。 3.HSF与不同浓度的PA溶液在48孔板共培养24h，qPCR实验检测HS形成相关基因的表达水平。 4.人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)与不同浓度的PA溶液以及100ng/mL的血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在96孔板共培养72h，CCK-8试剂盒被用于检测细胞活力。 5.HUVECs与不同浓度的PA溶液以及100ng/mL的VEGF在基质胶中共培养6h，使用OlympusCKX53显微镜观察并拍摄成管情况。使用ImageJ软件量化HUVECs的成管能力。 6.HUVECs与不同浓度的PA溶液以及100ng/mL的VEGF在48孔板共培养48h，qPCR实验检测血管形成相关基因的表达水平。 7.将透明质酸(Hyaluronicacid,HA)、明胶(Gelatin,Gel)和不同体积的PA储备溶液在去离子水中配制成不同浓度PA的微针基质溶液，倒入聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)微针模具中，于室温干燥脱模制备负载PA的HA微针(HA-PA-MN)或负载PA的HA和Gel的混合微针（HA/Gel-PA-MN）。 8.通过场发射扫描电镜(Scanningelectronmicroscope,SEM)观察载药微针的形貌图，电子万能材料试验机检测负载不同浓度PA的载药微针的机械强度。 9.HA-PA-MN或HA/Gel-PA-MN扎入兔耳的正常皮肤或HS中5分钟后取出，采集组织进行组织学分析，利用苏木素amp;伊红（Hamp;E）染色后的组织切片检测载药微针的皮肤穿透能力。 10.HA-PA-MN或HA/Gel-PA-MN扎入兔耳的正常皮肤或HS中不同时间后取出，使用Olympus体视显微镜观察载药微针的体内溶解速度。 11.创建兔耳HS模型，并将动物实验分为两组进行。预防组动物实验在建模14天开始干预，分为正常皮肤组（Normalskin）、空白对照组（HS）、PA涂抹组（PAcream）、空载HA微针组（HA-MN）和负载PA的HA微针组（HA-PA-MN）。治疗组在建模28天开始干预，分为Normalskin、HS、PAcream、HA-MN、空载HA和Gel混合微针组（HA/Gel-MN）、HA-PA-MN、和负载PA的HA和Gel混合微针组（HA/Gel-PA-MN）。干预时间均为14天，结束后采集动物标本进行组织学分析。Hamp;E染色用于计算疤痕升高指数（Scarelevationindex,SEI）和血管数量、Masson三色染色评估真皮内胶原容积分数（Collagenvolumefraction,CVF）、TUNEL荧光染色用于检测凋亡细胞。 12.以上所有结果均来自至少三个独立的实验。使用单因素方差分析方法测量统计差异。P＜0.05的值被认为具有统计学意义。 结果： 1．PA能够呈剂量依赖性并且特异性诱导HSF凋亡、抑制其细胞活力和胶原分泌能力，降低HSF中COL1A1、COL3A1和ACTA等胶原合成相关基因的表达，促进MMP3这一细胞外基质降解相关基因的表达。 2．PA呈剂量依赖性地抑制VEGF刺激的HUVECs的细胞活力以及血管形成能力，抑制其FGF2、HIF1A、ENOS等促血管形成相关基因的表达。 3．微针表征结果显示我们制备的载药微针有完整的形貌，足够的机械强度成功穿透HS，并且能够快速溶解。 4．动物实验结果显示载药微针使得兔耳HS外观更趋近于正常皮肤，且有效降低了兔耳HS的SEI、血管数量、CVF，增加了凋亡细胞数量，对HS有良好的防治效果。 结论： 在本研究中，我们证明了PA能够诱导HSF凋亡并抑制HSF胶原合成。此外，我们还证明了PA能够抑制VEGF诱导的HUVECs成血管能力。再有，通过我们设计的微针包裹PA策略，我们证明了PA-MN在体内能够有效的预防和治疗HS，且效果要远好于传统药物涂抹的方式。
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