摘要
水禽细小病毒包括番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）、鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）和新型鹅细小病毒（Novelgooseparvovirus,NGPV）。其中鹅细小病毒与番鸭细小病毒两者引起的疾病临床症状较为相似，死亡率和发病率较高，已成为世界水禽养殖的常见病之一。因受病毒变异、疫苗免疫效率、饲养管理等诸多因素的影响，GPV和MDPV仍然困扰着水禽养殖业的健康发展。NGPV是近年新出现的GPV和MDPV重组型病毒，在我国樱桃谷鸭、半番鸭和番鸭等品种鸭中已广泛流行，其感染会导致病鸭发育不良，消瘦，生长缓慢，对水禽养殖造成巨大的经济损失。为了解安徽省水禽细小病毒流行株的遗传变异情况，本研究对收集的疑似临床样本进行PCR鉴定，并对流行毒株的全基因组序列进行了分析，以期为安徽省水禽细小病毒的防控提供基础数据。VP3基因在水禽细小病毒中十分保守，包含病毒最主要的免疫保护性抗原。本研究通过对VP3基因序列进行优化，成功获得了具有免疫活性的VP3原核表达蛋白；并在此基础上建立了能够同时检测三种水禽细小病毒血清抗体的间接ELISA检测方法。论文的研究内容与结果如下： 1.水禽细小病毒全基因组克隆及序列分析：首先,对实验室收集的疑似GPV、MDPV及NGPV病料进行分离鉴定并对它们全基因序列进行克隆和测序，并将它们命名为：ANHUI-GPV、ANHUI-D和ANHUI-NGPV。结果表明：（1）它们基因组全长分别为4935bp、5062bp、5109bp。（2）遗传进化分析表明，毒株ANHUI-GPV与SQ0412、RC16和DY16鹅细小病毒毒株属同一分支，毒株ANHUI-D与GDNX和SAAS-SHNH番鸭细小病毒毒株遗传距离较近；毒株ANHUI-NGPV则与SC16新型鸭源性细小病毒毒株属于一个分支，与台湾的GPV病毒非常相似，是新基因型水禽细小病毒。（3）同源性分析结果显示，毒株ANHUI-GPV与RC16和DY16毒株全基因序列同源性最高，为99.3%；与FM毒株同源性最低，仅为81.3%。毒株ANHUI-D与SAAS-SHNH毒株全基因序列同源性最高，为99.0%；与ANHUI-NGPV毒株同源性最低，仅为84.3%。毒株ANHUI-NGPV全基因序列与SDHT16、SDLC01和SC16毒株同源性最高，为99.0%；与FM番鸭细小病毒株同源性最低，仅为80.7%。 2.为了探讨水禽细小病毒VP3抗原特性，建立VP3检测水禽细小病毒抗体检测方法：首先构建重组质粒pET32a-VP3，并对VP3基因序列测定与分析；再次进行外源性表达，将表达蛋白用于间接ELISA方法的建立。结果表明：（1）所得毒株ANHUI-GPV的VP3基因序列与RC16株序列同源性最高，为100%；与90-0219V番鸭细小病毒的同源性最低，仅为80.8%。ANHUI-D的VP3基因与SAAS-SHNH株同源性最高，为99.3%；与90-0219V株同源性最低，仅为85.3%。毒株ANHUI-NGPV的VP3基因与SDLC01株同源性最高，为98.1%；与90-0219v株同源性最低，仅为80.1%。（2）将优化好的VP3基因序列送生物公司构建重组质粒pET32a-VP3并鉴定，经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后，可发现54.22kDa大小目的条带，且具有良好的免疫学反应活性。（3）间接ELISA方法最优条件是重组VP3蛋白抗原包被浓度是40μg/mL；一抗最佳稀释比为1：400，反应时间为1h；二抗的稀释比例为1：300，反应时间为1h；底物反应时间为15min，并确定出阴阳性临界值为0.338。特异性试验和敏感性试验结果也显示：该方法具有特异性强，灵敏度高等特性，且批间、批内重复试验的变异系数均小于5%。由此可见，该方法具有较好的重复性。 综上，本研究对分离到的ANHUI-GPV、ANHUI-D和ANHUI-NGPV毒株的全基因组序列以及VP3基因的同源性和进化树进行了分析，为进一步研究水禽细小病毒的遗传进化特征和致病机理奠定了基础。此外，所建立的间接ELISA方法为调查水禽细小病毒的感染、雏禽母源抗体水平及疫苗免疫效果等提供了可靠的技术支持。
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