摘要
研究背景： 空气污染是一类重要且可干预的心血管疾病危险因素，暴露于空气污染，即使只是短期暴露，也与心肌梗死的死亡风险增加呈显著相关。临床证据表明，空气污染颗粒物（PM）可导致心肌梗死加重。苯并芘（Benzo[a]pyrene,BaP）是一种高毒性多环芳烃，是有机化合物不完全燃烧产生的污染物，也是可吸入颗粒物中的重要成分，被列为环境污染监测的主要对象之一。流行病学和毒理学研究均提示苯并芘暴露可能与心血管疾病的发病相关。鉴于颗粒物与心肌梗死死亡风险增加显著相关，而苯并芘又是颗粒物的重要成分且与心血管疾病发病相关，我们拟在动物与细胞模型中探讨苯并芘对心肌梗死的影响。 研究方法： 以异氟烷麻醉小鼠后，于其第三、四肋间处开胸并结扎冠状动脉的左前降支从而建立心肌梗死模型。随机将小鼠分为假手术组（Sham）、心肌梗死组（MI）以及苯并芘给药后的心肌梗死组（MI+BaP），并对其施以相应处理。苯并芘用中链甘油三酯溶解，从手术前四周开始通过腹腔注射给药，每周注射一次，剂量为10mg/kg。成功建立心肌梗死模型后，选取心肌梗死时间为一周的小鼠，采用超声心动图检测心脏功能的改变，并对左室射血分数（LVEF）、左室缩短率（LVFS）、左心室舒张末期内径（LVIDd）以及左室收缩末期内径（LVIDs）等数据进行统计分析；使用TTC染色法检测心肌梗死的面积。抽取小鼠血液并通过离心获得其上清，用于检测其中的心肌梗死特异性标志物如LDH、CK-MB、cTnI。选取左心室部位的心脏组织用于提取蛋白并进行免疫印迹实验，检测其中的线粒体自噬与焦亡的相关蛋白的水平。另用完整的心脏制成石蜡切片或冰冻切片进行HE染色、Masson染色、免疫组化及免疫荧光实验。 使用H9C2细胞实施糖氧剥夺（OGD）从而建立体外模型。细胞模型建立后，使用CCK-8法检测苯并芘的心脏毒性并筛选出苯并芘的适宜剂量。对处理后的细胞使用Hoechst33342与PI的共同染色来评估苯并芘对缺氧情况下心肌细胞造成的损伤。提取细胞蛋白进行免疫印迹实验，检测线粒体自噬与焦亡的相关蛋白的水平。处理后的细胞在经过固定、破膜以及封闭后进行免疫荧光实验，用于检测线粒体自噬与焦亡的关键蛋白。使用Lyso-Tracker与Mito-Tracker对细胞进行共同染色，以两种荧光探针的共定位情况来评估细胞的线粒体自噬水平。分别使用DHE与DCFH-DA荧光探针检测细胞的ROS水平。通过对比含或不含氯化钴的钙黄绿素探针的染色结果来评估细胞层面上线粒体膜通透性转换孔（mPTP）的开放水平。 研究结果： 1、苯并芘在体内外均可加重心肌梗死损伤 在体内实验的结果中，苯并芘使心肌梗死小鼠的心功能受损，表现为左室射血分数（LVEF）、左室缩短率（LVFS）下降以及左心室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）增加。同时，苯并芘增加了心肌梗死的面积，促进了心脏的炎症浸润与胶原沉积，令心肌梗死的血清学指标：LDH、CK-MB、cTnI升高。在体外实验中，苯并芘降低了糖氧剥夺（OGD）处理后H9C2细胞的存活率。 2、苯并芘通过NOD-likereceptor信号通路加重心肌梗死损伤 在对MI组与MI+BaP组的心肌梗死区域进行了高通量测序后，通过KEGG富集分析和GO富集分析，我们发现NOD-likereceptor信号通路在苯并芘加重心肌梗死损伤的过程中起到重要作用，NLRP3炎症小体的激活是其中的关键。 3、苯并芘在体内外均可通过加重NLRP3相关的细胞焦亡来加重心肌梗死 在体内和体外模型中，苯并芘均上调了NLRP3炎症小体相关蛋白如NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1的表达水平，并且上调了焦亡相关蛋白如GSDMD-N、IL-18、IL-1β的表达水平。 4、苯并芘在体内外通过抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬加重心肌梗死在体内和体外模型中，苯并芘给药使PINK1/Parkin的表达量下调、LC3Ⅱ/I比值明显降低，而P62的蛋白表达量升高，代表了线粒体自噬水平的下降。 5、苯并芘对线粒体自噬的抑制与芳香烃受体（AhR）的激活有关 在使用了芳香烃受体的抑制剂CH223191后，线粒体自噬的水平相比未给予CH223191时有所回升，代表抑制芳香烃受体能够消除部分苯并芘造成的线粒体功能损伤，即芳香烃受体的激活与线粒体自噬的抑制有关。 6、苯并芘对线粒体自噬的抑制促进了线粒体膜通透性转换孔（mPTP）的开放，从而增加活性氧（ROS）的释放 苯并芘处理后线粒体膜通透性转换孔的开放水平增加，而芳香烃受体的抑制剂CH223191能通过改善线粒体自噬减弱苯并芘的这一作用。同时，苯并芘处理使细胞中的活性氧释放增加，而使用线粒体膜通透性转换孔的开放抑制剂环孢素（CyclosporinA,CsA）能缓解这一现象。 7、苯并芘通过促进ROS释放来激活NLRP3炎症小体，从而加重NLRP3相关的细胞焦亡 在使用线粒体膜通透性转换孔的开放抑制剂CsA减少了苯并芘诱导的活性氧释放后，NLRP3炎症小体相关蛋白如NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1的表达量减少，同时焦亡相关蛋白如GSDMD-N、IL-18、IL-1β的表达量也下降。 研究结论： 1、苯并芘能够加重心肌梗死损伤 2、苯并芘通过促进NLRP3相关的细胞焦亡来加重心肌梗死 3、苯并芘在心肌梗死损伤中抑制了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬 4、苯并芘通过激活芳香烃受体来抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬 5、苯并芘通过抑制线粒体自噬促进了线粒体膜通透性转换孔的开放，从而增加ROS的释放，进而引导NLRP3炎症小体的激活，从而加重心肌细胞焦亡
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