摘要
随着科技不断进步，水产养殖业蓬勃发展，为了获得经济效益最大化，高密度养殖越来越受到养殖户的青睐。然而，高密度养殖又是细菌性疾病爆发的温床，一旦爆发，很容易造成鱼类大量的死亡，其造成的经济损失是不可估量的，再加上鱼药的广泛使用，鱼体的耐药性也越来越强，药物难以发挥应有的作用。因此，先天免疫仍旧是预防细菌性疾病最有效的方法，其重要性不言而喻。早期脊椎动物的进化主要是低等脊椎动物到高级脊椎动物的转化，鱼类则是低等脊椎动物的代表。所以，鱼类成为了一种极其合适的生物学模型来进行免疫学研究。转化生长因子β活化激酶（Transforminggrowthfactor-βactivatedkinase，TAK）1存在于核转录因子κB（nucleartranscriptionfactor-κB，NF-κB）信号中，是该信号通路中的主要上游调节因子之一，参与调节Toll样受体（Toll-likereceptor，TLR）介导的先天免疫反应，参与调节多种生理和病理过程。当上游因子被TLR激活，活性白细胞介素受体相关蛋白激酶（interleukinreceptor-associatedkinase，IRAK）会与下游因子特异性结合，例如TAK1和TNF受体相关因子（TNFreceptorassociatedfactor，TRAF）6并形成蛋白复合物，随后激活IκB激酶（inhibitorofNF-κBkinase，IKK）复合物，促进了催化性IKKβ亚基的激活，进而促进细胞释放炎症因子引发炎症反应。因此，靶向TAK1可能有很大的潜力来调控细菌性疾病产生的炎症反应。本研究选择了鮸鱼（Miichthysmiiuy）作为研究模型，研究了鮸鱼先天免疫反应的调控机制，主要研究结果如下： 1、鮸鱼PSMD13基因经过研究发现，具有一个潜在的PINT结构域。将其氨基酸序列与人、鼠和斑马鱼进行比对后，发现在物种间，PSMD13基因的差异非常小，尤其是PINT结构域部分具有高度保守的序列。同时，通过使用SWISS-MODEL网站分别建立了不同物种的PSMD13蛋白的三维结构图，证明它们在空间结构上基本一致，也进一步说明了PSMD13在不同物种间的高度保守性。最后，利用MEGA7.0构建PSMD13基因进化树，发现鱼类和哺乳动物类之间虽有差异，但种间差异较小，进一步证明了PSMD13在进化上的保守性。 2、经研究发现，哈维氏弧菌感染鮸鱼肾细胞（MKC）后，PSMD13的表达量会激增，这说明PSMD13参与了细菌感染下细胞的先天免疫反应。接着，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激MKC，发现PSMD13能够有效抑制NF-κB信号通路的激活。通过双荧光素酶报告基因检测实验，还发现LPS刺激会导致EPC细胞中炎症因子mRNA表达量的升高，例如肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-8等，而PSMD13则抑制了这一过程，这表明PSMD13不仅参与了细菌刺激下的NF-κB信号通路，同时也发挥了抑制作用。 3、TAK1作为NF-κB信号通路中非常重要的调节转导因子，一直以来都备受研究者关注。为了更好地理解PSMD13参与先天免疫反应的方式，利用LPS刺激MKC，检测了PSMD13对TAK1mRNA的影响。结果表明PSMD13能够在转录水平上抑制TAK1的表达。进一步实验发现，随着PSMD13浓度的升高，通过TAK1介导的NF-κB信号通路炎症因子的荧光素酶报告基因活性就越低，最终证明了PSMD13通过靶向TAK1调控NF-κB信号通路的方式参与了先天免疫反应。 4、在确认了PSMD13对TAK1转录水平的影响后，本文进一步探究了这两种蛋白的相互关系。通过免疫共沉淀实验，研究结果证实了它们之间存在互作关系。细胞共定位实验也发现这两种蛋白都在细胞质中。接着，通过浓度梯度实验和时间梯度实验，明确了PSMD13抑制了TAK1的蛋白表达水平。同时在使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）的作用下，TAK1的半衰期被PSMD13缩短，这也进一步确认了PSMD13能够抑制TAK1蛋白的表达。 5、随后的实验结果表明，MG132可以阻断PSMD13对TAK1表达的抑制作用。随着MG132浓度的逐渐增加，PSMD13对TAK1蛋白的影响逐渐减弱。因此，可以得出结论：PSMD13可能是通过蛋白酶体途径抑制了TAK1的表达。将野生型泛素质粒转入细胞后，泛素化实验结果显示，PSMD13能够显著抑制TAK1的体外泛素化水平。为了进一步探究PSMD13抑制TAK1的泛素化类型，实验针对泛素分子常见的K27、K48和K63连接方式进行了泛素化实验。结果表明，PSMD13主要抑制了TAK1-K63连接的泛素化，这一结果也经过了后续关于PSMD13的浓度实验的证明。
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