摘要
背景: 非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是一种常见的代谢性疾病，被视为代谢综合征(metabolicsyndrome,MS)的肝脏表型，其疾病谱广泛，包括了从脂肪变性、炎症到纤维化。随着肥胖、糖尿病和MS患病率的增加，NAFLD已变得越来越普遍。NAFLD的发生和发展与代谢紊乱密切相关，因此，改善代谢是药物研发重点关注的治疗靶点，促进脂肪酸氧化是改善代谢中的重要环节，研究表明促进脂肪酸氧化能够减轻肝脏脂质沉积，胰岛素抵抗，线粒体应激和氧化应激。PPARα是调控脂肪酸β氧化的关键因子，且有研究发现SIRT6与PPARα结合，协同促进脂肪酸β氧化，但两者相互作用机制的研究结果不一致，还有待探索。另外，本课题组一直致力于芪葛汤(Qigedecoction,QG)药效作用及其机制的研究，前期大量的动物和细胞实验证实QG能够减轻肝脏脂质变性和细胞内脂质堆积，还具有肝脏保护作用。前期研究也初步提示QG能够增加高脂血症大鼠肝脏中SIRT6、PPARα及其脂肪酸氧化通路下游的直接靶基因CPT-1、ACOX1等的mRNA和蛋白水平(叶晋通博士论文,内容暂未发表)。QG是否通过激活SIRT6-PPARα信号通路促进脂肪酸氧化，从而改善NAFLD的病理状态，其具体的分子机制还有待进一步研究完善。 目的: 1.探索SIRT6、PPARα相互作用的分子机制，研究SIRT6-PPARα信号通路对脂肪酸氧化和NAFLD小鼠表型的作用。 2.研究QG激活SIRT6-PPARα信号通路，调控脂肪酸氧化，改善NAFLD表型的分子机制，为QG在临床上的应用提供实验依据。 方法: 第一部分SIRT6-PPARα信号通路调控NAFLD脂肪酸氧化的机制研究 (1)基于转录组学和脂质组学研究SIRT6-PPARα信号通路调控肝脏脂肪酸氧化的机制 给予C57BL/6J小鼠高脂饮食8周建立NALFD小鼠模型，同时，用PPARα激动剂(WY-14643,WY)、SIRT6抑制剂(OSS-128167,OS)干预NAFLD小鼠8周，每周记录体重，8周后测量小鼠体重、肝重、脂肪重，检测血脂和肝功能，肝组织HE染色和油红O染色，HE染色基础上进行NAFLD活动度积分(NAFLDactivityscore,NAS)评分，对油红O染色进行定量。转录组学揭示WY、OS干预后的基因表达谱，脂质组学揭示药物干预引起的代谢物变化，两者结合探索WY、OS干预的靶通路及基因。qRT-PCR验证SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、ACADL、ACADM、EHHADH的mRNA水平，WesternBlot检测SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白水平。 (2)体外研究SIRT6与PPARα互作影响脂质堆积的机制 利用慢病毒感染HepG2细胞构建SIRT6下调稳定表达的体外模型，在此基础上用油酸500μM和棕榈酸250μM(OA+PA)干预建立高脂细胞模型，检测野生型(LV-CON313)和SIRT6下调(LV-SIRT6-RNAi)的高脂细胞内TG含量和油红O染色。WesternBlot检测两组细胞的SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白水平。Co-IP实验检测SIRT6、PPARα在HepG2细胞中的结合情况。双荧光素酶报告实验检测SIRT6对PPARα启动子的激活情况。 第二部分基于转录组学和脂质组学研究QG激活SIRT6-PPARα信号通路调控肝脏脂肪酸氧化改善NAFLD的机制 用低剂量QG(QGL,6.8g/kg)和高剂量QG(QGH,13.6g/kg)干预高脂饮食诱导的NAFLD小鼠8周，每周记录体重，8周后测量小鼠体重、肝重、脂肪重，检测血脂和肝功能，肝组织HE染色和油红O染色，HE染色基础上进行NAS评分，对油红O染色进行定量。转录组学揭示QGL、QGH干预后的基因表达谱，脂质组学揭示QGL、QGH干预引起的代谢物变化，两者结合探索QGL、QGH干预的靶通路及基因。qRT-PCR验证SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、ACADL、ACADM、EHHADH的mRNA水平，WesternBlot检测SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白水平。 第三部分基于高脂细胞模型研究QG介导SIRT6-PPARα信号通路调控脂肪酸氧化的机制 CCK8实验筛选QG水煎液无细胞毒性的干预浓度，进一步使用QG水煎液干预OA+PA诱导的高脂细胞模型，检测细胞内TG含量和细胞油红O染色，筛选QG水煎液最佳干预浓度。WesternBlot检测SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白水平。再用QG水煎液干预野生型高脂细胞和SIRT6下调高脂细胞，检测细胞内TG含量和细胞油红O染色，并检测两组细胞中SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH表达水平，了解QG对脂肪酸氧化的调控和减少脂质堆积的作用是否依赖于SIRT6。 结果: 第一部分SIRT6-PPARα信号通路调控NAFLD脂肪酸氧化的机制研究 (1)基于转录组学和脂质组学研究SIRT6-PPARα信号通路调控肝脏脂肪酸氧化的机制 建立了NAFLD小鼠模型，与空白对照(CON)组相比，模型(MOD)组体重、肝重、脂肪重及肝指数明显升高，TC、LDL、ALT明显增高，TG、HDL和AST无明显差异。NAS评分提示MOD组的肝脏脂肪变性、小叶炎症，以及NAS总评分均明显高于CON组。MOD组的油红O染色面积明显高于CON组。与MOD组相比，WY组肝重、肝指数明显升高，体重与脂肪重无明显差异，TC、TG、LDL、ALT和AST明显降低，HDL明显升高。NAS评分提示WY组肝脏脂肪变性、小叶炎症及NAS总评分明显低于MOD组。WY组油红O染色面积明显低于MOD组。与MOD组相比,OS组的脂肪重明显升高，体重、肝重和肝指数无明显变化，LDL明显升高，HDL明显降低，TC、TG、ALT和AST无明显差异。NAS评分提示OS组与MOD组脂肪变性、小叶炎症和NAS总评分无统计学差异，OS组见气球样变性，但与MOD组无统计学差异。OS组油红O染色面积与MOD组相比无统计学差异。 转录组学结果提示，WY组与MOD组相比，大量脂肪酸氧化相关的PPARα靶基因上调，两组差异基因(differentialgenes,DEGs)富集的前三条通路为:PPAR信号通路、脂肪酸降解、过氧化物酶体。脂质组学结果提示WY组与MOD的差异脂质代谢物(differentiallipids,DELs)富集到的KEGG通路中胰岛素抵抗、甘油酯代谢与脂肪酸氧化有关，且WY组乙酰肉碱含量升高。转录组学结果提示OS组与MOD组相比，虽然脂肪酸氧化相关基因未见统计学差异，但与CON组相比，PPARα下游靶基因的转录水平在OS组和MOD组中变化趋势基本一致，而OS组的变化趋势更明显,且OS组与CON组的脂肪酸氧化相关DEGs比MOD组与CON组的脂肪酸氧化相关DEGs多，主要包括PPARα、FABP4、FABP7、ACCA1a、ACCA1b。脂质组学结果提示OS组与MOD的DELs富集到的KEGG通路中甘油酯代谢与脂肪酸氧化有关，且OS组有加重磷脂类、甘油酯类和硬脂酸在肝脏堆积的趋势。 qRT-PCR提示与MOD相比，WY组的SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、ACADL、ACADM和EHHADH的mRNA水平均上调,WesternBlot提示WY组的PPARα、CPT1α、ACOX1和EHHADH的蛋白表达上调。qRT-PCR结果提示OS组SIRT6、PPARα、CPT1α和EHHADH的mRNA下调，Westernblot结果提示OS组SIRT6、PPARα、CPT1α蛋白下调。 (2)体外研究SIRT6与PPARα互作影响脂质堆积的机制 在体外成功构建了SIRT6下调细胞模型。OA+OP干预后的LV-SIRT6-RNAi组的脂质堆积明显高于LV-CON313组。WesternBlot提示LV-SIRT6-RNAi组的SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1和EHHADH蛋白均下调。Co-IP实验提示SIRT6与PPARα在HepG2细胞中存在相互作用。双荧光素酶报告实验提示SIRT6未激活PPARα启动子。 第二部分基于转录组学和脂质组学研究QG激活SIRT6-PPARα信号通路调控肝脏脂肪酸氧化改善NAFLD的机制 与MOD组相比，QGL、QGH组小鼠体重明显降低，肝重、肝指数、脂肪重无明显差异，TC、TG、LDL、ALT明显降低，HDL明显升高，AST无明显差异。NAS评分提示与MOD组相比，QGL明显减轻肝脏脂肪变性以及NAS总评分。QGH组能够明显减轻肝脏脂肪变性、改善小叶炎症以及NAS总评分。QGL和QGH组油红O染色面积比MOD组明显减少。 转录组学结果提示与MOD组相比，QGL、QGH能够上调大多数脂肪酸氧化相关基因，而QGH上调基因数目比QGL多，QGL与MOD组的DEGs富集的前三条通路为:PPAR信号传导途径、过氧化物酶体、视黄醇代谢;QGH与MOD组的DEGs富集的前三条通路为:PPAR信号通路、脂肪酸降解、过氧化物酶体。脂质组学结果提示QGH组回调的DELs比QGL组更多且趋势更明显。QGL组与MOD的DELs富集到的通路中:胰岛素抵抗、甘油酯代谢与脂肪酸氧化有关，QGL组1种长链脂酰肉碱含量明显降低。QGH组与MOD的DELs富集到的通路中虽然没有与脂肪酸氧化直接相关的通路，但QGH组与MOD相比，有4种长链脂酰肉碱含量降低，乙酰肉碱含量增多，提示QGH组脂肪酸氧化增加。 qRT-PCR结果提示与MOD组相比,QGL组的SIRT6、PPARα、CPT1α、EHHADH、ACADM的mRNA升高，ACOX1、ACADL无明显差异;QGH组中SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH、ACADL、ACADM的mRNA升高。Westernblot结果提示，QGL能够上调SIRT6、PPARα、CPT1α、EHHADH蛋白水平，QGH能够上调SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白水平。 第三部分基于高脂细胞模型研究QG介导SIRT6-PPARα信号通路调控脂肪酸氧化的机制 结合CCK8实验、TG检测和油红O染色筛选出QG水煎液的最佳干预浓度为0.5mg/mL。与MOD组相比，QG组细胞内TG含量减少，油红O染色提示QG能够减少细胞内的脂质堆积。WesternBlot发现MOD组细胞SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白下调，而在SIRT6下调时QG改善细胞内TG和脂质堆积的作用明显降低，上调SIRT6、PPARα、CPT1α、ACOX1、EHHADH蛋白表达的作用也明显降低。 结论: SIRT6-PPARα信号通路调控肝脏脂肪酸氧化，下调SIRT6抑制了PPARα介导的脂肪酸氧化，加重NAFLD血脂紊乱，肝脏脂质堆积及炎性病变。SIRT6与PPARα在HepG2细胞中相互结合，本研究中SIRT6未激活PPARα启动子，两者作用机制还有待进一步研究。 QG改善NAFLD小鼠血脂紊乱，减轻肝脏脂肪变性和小叶炎症，这可能是由于QG能够激活SIRT6-PPARα信号通路，促进脂肪酸氧化相关基因的表达，增加肝脏脂肪酸氧化。
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