摘要
目的：建立纳米氧化镍（NanoNickelOxide,NiONPs）诱导的大鼠肺组织和人肺腺癌上皮细胞（A549细胞）炎性损伤模型，探讨长链非编码RNA（lncRNA）MEG3和p38信号通路在纳米氧化镍致大鼠肺组织炎性损伤中的作用机制。 方法：1.体内实验设计：选择健康成年雄性Wistar大鼠64只，随机分为0、0.015、0.06和0.24mg/kg纳米氧化镍组，通过气管滴注进行染毒，2次/周，连续9周。收集大鼠肺泡灌洗液（BALF）和肺脏。2.体外实验设计：（1）采用0、25、50、100μg/mL纳米氧化镍混悬液处理A549细胞24h。收集细胞和细胞培养上清液。（2）10μMp38信号通路抑制剂（SB203580）预处理A549细胞1h后，用100μg/mL纳米氧化镍、p38信号通路抑制剂（SB203580）、100μg/mL纳米氧化镍联合10μMSB203580处理A549细胞24h。收集细胞用于后续实验。（3）100μg/mL纳米氧化镍分别处理正常A549细胞、过表达MEG3的A549细胞（LV-MEG3A549）、空载质粒重组慢病毒的A549细胞（LV-NCA549）24h。收集细胞和细胞培养上清液。3.指标测定：（1）称量大鼠体重和肺脏湿重，计算肺脏器系数。（2）电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP-AES）检测大鼠肺组织中镍离子的含量。（3）制备大鼠肺组织苏木精-伊红（HE）染色组织切片，光学显微镜下观察大鼠肺损伤程度。（4）收集大鼠BALF细胞，通过台盼蓝染色法、迪夫快速染色法对总细胞和各类炎性细胞进行计数。（5）RT-qPCR检测大鼠肺组织中炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α、IFN-γ、IL-10和趋化因子CXCL1、CXCL2及p38的mRNA表达水平。（6）Elisa法测定大鼠BALF和细胞培养上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α、IFN-γ、IL-10及趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平。（7）免疫印迹法（Westernblot）检测大鼠肺组织和A549细胞中炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α、IFN-γ、IL-10和趋化因子CXCL1、CXCL2及p38信号通路（p38和p-p38）的蛋白表达水平。 结果：1.体内实验：（1）纳米氧化镍对大鼠体重和肺脏器系数的影响：自第5周开始，0.06和0.24mg/kg纳米氧化镍组大鼠体重低于对照组，而肺湿重和肺脏器系数高于对照组（P＜0.05）。（2）纳米氧化镍对肺组织镍离子含量的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组大鼠肺组织镍离子含量升高（P＜0.05）。（3）纳米氧化镍对大鼠肺组织病理学影响：纳米氧化镍组大鼠出现肺泡间隔增宽，肺泡腔缩小及炎性细胞浸润，尤以0.24mg/kg纳米氧化镍组变化显著。（4）纳米氧化镍对BALF活细胞总数和炎性细胞比例的影响：0.24mg/kg纳米氧化镍组大鼠BALF活细胞总数以及中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞所占百分比均高于对照组，而巨噬细胞和嗜碱性粒细胞所占百分比均低于对照组（P＜0.05）。（5）纳米氧化镍对大鼠BALF炎性因子的影响：相较于对照组，0.06和0.24mg/kg纳米氧化镍组大鼠BALF促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1以及趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平均升高，而抑炎因子IFN-γ和IL-10的蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。（6）纳米氧化镍对大鼠肺组织中炎性因子基因和蛋白表达水平的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组大鼠肺组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α和趋化因子CXCL1、CXCL2的基因和蛋白水平均升高，而抑炎因子IFN-γ和IL-10的基因和蛋白水平均降低（P＜0.05）。以上结果表明，纳米氧化镍可引起大鼠肺组织发生炎性损伤。（7）纳米氧化镍对大鼠肺组织p38信号通路的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组肺组织p-p38水平、p-p38/p38比值以及p38的mRNA表达水平均升高（P＜0.05），提示纳米氧化镍激活了大鼠肺组织p38信号通路。（8）纳米氧化镍对大鼠肺组织MEG3表达的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组大鼠肺组织MEG3表达水平降低（P＜0.05）。2.体外实验：（1）纳米氧化镍对A549细胞炎性因子表达的影响：相较于对照组，100μg/mL纳米氧化镍组A549细胞培养上清液中促炎因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α和趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平均升高，而抑炎因子IFN-γ和IL-10的蛋白表达水平均降低（P＜0.05），提示纳米氧化镍可引起A549细胞炎性损伤。（2）纳米氧化镍对A549细胞p38信号通路的影响：相较于对照组，50和100μg/mL纳米氧化镍组细胞p-p38水平及p-p38/p38比值均升高（P＜0.05），提示纳米氧化镍激活了A549细胞p38信号通路。（3）p38信号通路抑制剂（SB203580）对纳米氧化镍诱导的A549细胞炎性因子分泌的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组A549细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1和趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平均升高，而抑炎因子IFN-γ、IL-10的蛋白水平均降低（P＜0.05）。与纳米氧化镍组比较，纳米氧化镍+SB203580组细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1和趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白水平均降低，而抑炎因子IFN-γ和IL-10的蛋白水平均升高（P＜0.05）。结果表明，纳米氧化镍可激活细胞p38信号通路，进而促使A549细胞分泌大量炎性因子而致细胞发生炎性损伤。（4）MEG3对纳米氧化镍激活的A549细胞p38信号通路的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组和纳米氧化镍+LV-NC组细胞中p-p38水平和p-p38/p38比值均升高（P＜0.05）。纳米氧化镍+LV-MEG3组细胞中p-p38水平和p-p38/p38比值均低于纳米氧化镍组（P＜0.05）。结果提示MEG3可阻抑纳米氧化镍激活的p38信号通路。（5）MEG3对纳米氧化镍诱导的A549细胞炎性因子分泌的影响：相较于对照组，纳米氧化镍组、纳米氧化镍+LV-NC组细胞培养上清液中促炎因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α和趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平均明显升高，而抑炎因子IFN-γ、IL-10的蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。与纳米氧化镍组比较，纳米氧化镍+LV-MEG3组细胞培养上清液中促炎因子IL-1β、IL-6、TGF-β1、TNF-α和趋化因子CXCL1、CXCL2的蛋白表达水平均下降，而抑炎因子IFN-γ、IL-10的蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。结果表明，MEG3可减轻纳米氧化镍诱导的细胞炎性损伤。 结论：纳米氧化镍可诱导大鼠肺组织发生炎性损伤，其机制与纳米氧化镍引起肺组织lncRNAMEG3表达下调而激活p38信号通路有关。
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