摘要
胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）是大脑中最常见的原发性恶性肿瘤，具有极强的侵袭性和多样性，5年生存期仅约5%。目前，对GBM的研究非常有限。由于血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在和免疫系统的抑制，使得GBM的治疗也严重受限。患者通常需要包括手术、放疗和化疗在内的多种方法的组合治疗，但疗效不佳。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）作为治疗GBM的一线化疗药物，因其耐药性引起的高复发率使得治疗效果有限。此外，针对GBM热门靶点开发的药物进展受阻。因此，探索高效和低毒的药物来治疗GBM将是提高患者生存期和改善预后的迫切需要。野鸢尾黄素作为一种异黄酮类化合物，具有潜在的抗GBM活性，但具体的药效和作用机制还需进一步研究。 目的： 迄今，野鸢尾黄素在GBM中的作用及其机制尚不清楚，本课题旨在探讨野鸢尾黄素对GBM的作用及YAP/β-catenin对GBM的调控机制。 方法： （1）以C6和DBTRG细胞系为实验对象，通过细胞活力检测试剂盒（CCK8）检测GBM细胞的活性，采用平皿克隆、PH3细胞免疫荧光染色检测野鸢尾黄素对GBM细胞的增殖作用影响。 （2）通过划痕实验和transwell实验检测野鸢尾黄素对GBM细胞的迁移作用的影响；采用qPCR检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2和MMP-9mRNA表达水平的变化。 （3）荧光染料碘化丙啶（propidium iodide,PI）染色、流式细胞术、Cleaved-Caspase3细胞免疫荧光染色分别检测野鸢尾黄素对GBM细胞的周期和凋亡作用的影响，WB用于检测野鸢尾黄素对GBM细胞凋亡相关因子以及细胞周期蛋白的表达水平变化。 （4）通过WB和免疫荧光检测野鸢尾黄素对YAP/β-catenin通路相关因子的蛋白表达水平影响。 （5）通过分子对接技术研究野鸢尾黄素与YAP和β-catenin的相互作用，并分析它们之间的作用方式。 （6）在GBM细胞系C6中构建YAP过表达细胞株，通过CCK8实验、划痕实验、transwell实验等研究YAP在野鸢尾黄素抑制GBM上发挥的重要作用。 （7）在胶质瘤原位移植模型中采用小动物肿瘤成像，通过免疫组织化学染色等研究野鸢尾黄素在体内对GBM发挥的作用。 结果： （1）设置不同药物浓度梯度，通过CCK8实验检测作用24h和48h的IC50值。结果显示，野鸢尾黄素能呈剂量、时间依赖性地抑制GBM细胞增殖。PH3细胞免疫荧光染色，细胞克隆实验也表明IC50浓度下野鸢尾黄素对GBM细胞增殖起显著的抑制作用。（2）流式细胞术和Western blot结果表明，野鸢尾黄素能够将GBM细胞阻滞在G2/M期。（3）流式细胞术，Western blot，C-C3细胞免疫荧光染色，PI染色结果显示野鸢尾黄素可以诱导GBM细胞凋亡。（4）划痕实验和transwell实验表明GBM细胞在IC50浓度作用下，与对照组相比迁移能力降低。q-PCR实验结果表明MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平下调，这也与迁移能力降低有关。（5）YAP细胞免疫荧光染色和Western blot结果表明野鸢尾黄素能够下调GBM中YAP信号的表达。同时Western blot结果也表明YAP通路相关信号分子的蛋白表达水平也发生了变化。（6）β-catenin细胞免疫荧光染色和Western blot结果表明野鸢尾黄素能够下调GBM细胞中β-catenin信号的表达。（7）CCK8实验、划痕、transwell、PH3染色和Western blot结果显示过表达YAP可以部分逆转野鸢尾黄素的抗GBM作用，证实YAP是野鸢尾黄素诱导GBM细胞死亡的关键靶点，且会引起下游β-catenin蛋白表达水平的变化。（8）分子对接结果也进一步证明了野鸢尾黄素与YAP和β-catenin具有很强的亲和力。（9）脑立体原位造模后小动物成像和免疫组织化学染色表明野鸢尾黄素可以通过抑制YAP/β-catenin信号在体内发挥抗GBM的作用。 结论： 我们的研究结果表明，野鸢尾黄素以时间、剂量依赖的方式抑制GBM细胞的增殖和迁移，将细胞周期阻滞在G2/M期，并诱导GBM细胞的凋亡。进一步研究发现，野鸢尾黄素处理降低了GBM细胞中YAP的表达，抑制了β-catenin信号传导。过表达YAP部分逆转了野鸢尾黄素对体外GBM细胞的抗肿瘤作用。最后，异种移植小鼠模型结果显示野鸢尾黄素通过拮抗YAP影响β-catenin的表达水平抑制GBM生长。以上结果表明，野鸢尾黄素通过抑制YAP/β-catenin信号传导发挥抗GBM的作用，为GBM的治疗提供了一种新的靶点。
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