摘要
背景和目的：胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是临床常见的恶性肿瘤之一。因其早期及部分中期患者未见特异性临床症状，往往发现时已成晚期，难以手术治疗，同时，其化学治疗的疗效常常不佳，故病死率较高。胰岛素受体酪氨酸激酶底物（insulin receptor tyrosine kinase substrate，IRTKS）是一个新发现的胰岛素信号通路调控分子。各项研究表明 IRTKS 与癌症特别是消化系统肿瘤的发生发展和预后密切相关，但 IRTKS 参与调控胰腺癌的具体分子机制尚不清楚。本课题旨在揭示 IRTKS 表达水平与胰腺癌患者临床病理学特征和诊断预后之间的关联，阐明 IRTKS 表达水平对胰腺癌细胞生物学活动的影响，同时初步探究IRTKS影响胰腺癌发生发展的相关分子调控机制。 方法：收集TCGA和GTEx数据库的样本信息，分析IRTKS在包括胰腺癌的多种肿瘤中的表达情况。进行免疫印迹实验（Western Blot, WB）分析IRTKS在胰腺癌细胞和正常胰腺细胞的表达差异。收集64例胰腺癌和4例正常胰腺标本，进行免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）染色并分析IRTKS相对表达值；同时收集患者临床信息，进行 IRTKS 表达与胰腺癌临床病理参数的关联性分析，绘制时间依赖性ROC曲线和生存曲线，构建Cox比例风险回归模型，并对TCGA和GTEx胰腺癌数据绘制诊断性ROC曲线。建立IRTKS过表达/敲减的胰腺癌细胞系，并建立相应的对照细胞系，采用 CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell 实验观察 IRTKS 对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。以GSE46385胰腺癌mRNA芯片数据的 IRTKS表达值中位数分组，进行转录组的差异表达分析，并进行KEGG和GSEA分析探索IRTKS在胰腺癌中的调节功能和分子通路。进行免疫印迹实验在IRTKS过表达/敲减细胞系中验证下游信号通路PI3K/AKT的变化。在IRTKS过表达细胞系中使用PI3K抑制剂LY294002负向调节PI3K/AKT通路，采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验观察PI3K/AKT通路抑制后胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变，验证胰腺癌中IRTKS-PI3K/AKT轴的间接调控通路。 结果：TCGA和GTEx数据分析结果显示，IRTKS在包括胰腺癌的多种肿瘤中表达增高（P＜0.05）。免疫印迹实验结果显示IRTKS在人胰腺癌细胞系PANC-1（PANC）和 MIA PaCa-2（PACA）中的表达水平显著高于人正常胰腺导管上皮细胞系 hTERT-HPNE（P＜0.001）。对胰腺癌患者的临床病理资料分析结果显示，IRTKS 的表达与肿瘤分化程度具有相关性（P=0.024）；单因素及多因素分析结果显示，IRTKS 可作为预测胰腺癌患者预后的独立危险因素（HR=3.000, 95%CI:1.415-6.361, P=0.004）。诊断性ROC曲线分析结果显示，IRTKS对胰腺癌具有良好的诊断准确性（AUC= 0.891, 95%CI：0.855-0.926）。时间依赖性 ROC曲线分析结果显示，IRTKS 高表达可预测胰腺癌患者的不良预后（1 年AUC=0.622, 95%CI：0.496-0.747；2 年 AUC=0.640，95%CI：0.487-0.793）。生存分析结果显示，IRTKS 表达水平较高的患者生存时间较短（HR=2.16, 95%CI: 1.14?4.08, P=0.018）。在 IRTKS过表达的 PANC和 PACA胰腺癌细胞系中进行CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell实验，观察到增殖、迁移和侵袭能力的显著增强（P＜0.05）；相反，IRTKS 敲减细胞系中观察到增殖、迁移和侵袭能力的显著抑制（P＜0.05）。基于GSE46385数据集的KEGG分析显示IRTKS在胰腺癌中的差异表达基因显著富集于 PI3K/AKT 通路（P＜0.05）；GSEA 分析显示IRTKS 高表达与胰腺癌、细胞周期、细胞迁移、癌症转移和 PI3K/AKT 通路具有显著的正相关性（P＜0.05）。在 IRTKS过表达/敲减细胞中检测 PI3K、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（phosphorylated AKT， p-AKT）的蛋白表达水平，结果显示，与对照组相比，IRTKS 过表达组中上述蛋白的表达水平增高，且 p-PI3K/ PI3K 比值和 p-AKT/ AKT 比值显著增加（P＜0.05）；在敲减组中观察到了相反的实验结果（P＜0.05）。在 IRTKS 过表达细胞中加入PI3K特异性抑制剂LY294002，以IRTKS过表达细胞系作为对照，观察到LY294002处理后细胞增殖、迁移和侵袭能力的显著减弱（P＜0.05）。 结论：IRTKS 在胰腺癌发生及进展过程中具有明确的致癌作用，其在肿瘤组织中的过表达状态与胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的生物学功能密切相关。机制研究表明 IRTKS通过激活 PI3K/AKT通路促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能。IRTKS 或可作为新的胰腺癌分子标志物，为临床诊疗提供潜在的靶点和思路。
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