摘要
甲壳动物的卵巢脂类和蛋白一般为外源运输进入，其中包括了脂类和蛋白分别进入卵巢的单独运输模式及脂类和蛋白结合在一起形成脂蛋白（apolipoprotein）的共同运输模式。这些脂蛋白在极性条件下介导非极性脂类运输至关重要，同时和甲壳动物蜕壳免疫和性腺发育密切相关。因此基于多组学联合分析挖掘甲壳动物三种载脂蛋白基因及表达模式，在此基础上进行功能解析，对于理解甲壳动物营养生理学和功能基因进化具有一定的理论意义，且对于提高经济甲壳动物人工养殖和繁殖技术有一定的参考价值。 主要研究结果如下： 1、中华绒螯蟹，克氏原螯虾及凡纳滨对虾血淋巴蛋白质组分析 通过对中华绒螯蟹、克氏原螯虾及凡纳滨对虾血淋巴蛋白质组分析。三个物种的血淋巴中分别鉴定出153，69，323个蛋白质，在雄性中华绒螯蟹，未成熟雌性凡纳滨对虾和雄性克氏原螯虾血淋巴鉴定出的蛋白数量较多。其中很多与脂质代谢和氨基酸代谢相关的蛋白在血淋巴富集。本研究共筛选出了三种主要脂蛋白：高密度脂蛋白-β-1,3葡聚糖结合蛋白（HDL-BGBP）、凝血蛋白（CPs）和卵黄蛋白（Vg）。这些脂蛋白主要参与脂质的转运，卵巢发育和凝血过程。综上，在三种典型甲壳动物血淋巴中，鉴定出三种典型脂蛋白，其中凡纳滨对虾鉴定出10个HDL-BGBP蛋白，9个Vg蛋白，1个凝血蛋白，1个载脂蛋白受体A；中华绒螯蟹鉴定出1个HDL-BGBP蛋白，1个Vg蛋白；克氏原螯虾共鉴定3个HDL-BGBP蛋白，1个未知载脂蛋白，6个Vg蛋白。BGBP在雌性和雄性组别中均有出现，Vg蛋白是雌性特有蛋白。 2、主要经济甲壳动物脂蛋白全基因组分析 为研究甲壳动物脂蛋白相关基因的进化关系和结构特征，本研究选取了16种典型卵生动物，包括节肢动物和卵生哺乳动物进行全基因组学分析。结果显示，共筛选出 38 种 HDL-BGBP 基因，其中 35 种 BGBP 基因主要参与免疫反应，3 种BGBP基因则是主要参与脂质转运，均为十足目甲壳动物，在系统发育树中独立一簇。共鉴定54个Vg基因，卵生哺乳动物在进化关系上较为独立，十足目甲壳动物聚在一簇，在蚤类动物中鉴定出较多Vg基因，同时含有多种同源基因。鉴定出12种凝血蛋白，除大型蚤外，9种凝血蛋白在十足目甲壳动物中被发现，在进化关系上分为两簇。脂蛋白在进化中符合甲壳动物物种进化关系，十足目动物单独进化为一簇，包括中华绒螯蟹，克氏原螯虾及凡纳滨对虾。 3、 基于转录组探究凡纳滨对虾和中华绒螯蟹脂蛋白基因表达模式 本研究对凡纳滨对虾卵巢发育时期卵巢和肝胰腺进行了转录组学分析。结果显示，卵巢和肝胰腺中脂质代谢相关基因在肝胰腺显著上调，研究表明肝胰腺是卵巢发育时期脂质代谢的主要器官。鉴定出主要脂蛋白基因及其受体基因，包括肝胰腺型卵黄蛋白，卵巢型卵黄蛋白，载脂蛋白D，凝血蛋白，β-葡聚糖结合蛋白，卵黄蛋白受体，低密度脂蛋白受体，极低密度脂蛋白受体等。特别是卵黄蛋白，定量PCR 结果表明，确实存在两种卵黄蛋白 Vg-H, Vg-O，在卵巢发育过程中其表达模式似乎不同。 对中华绒螯蟹蜕皮周期的肝胰腺进行了转录组学分析。结果显示，中华绒螯蟹的肝胰腺中共有9081个基因参与到代谢进程，其中481个基因富集到能量代谢途径；进一步分析肝胰腺脂质代谢相关基因，结果显示大部分脂肪酸合成基因在蜕皮前期显著上调，包括乙酰辅酶A羧化酶，脂肪酸合成酶，长链脂肪酸辅酶A连接酶等。此外，还有与甘油三酯合成相关的的基因，如SN-1-甘油-3-磷酸酰基转移酶，乙酰辅酶A合成酶,1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶。综上，甘油三酯的合成在蜕皮间期和蜕皮前期达到峰值，脂滴累积，表明脂肪酸和甘油三酯的代谢对中华蜕皮周期中肝胰脂质代谢起重要作用。 4、凡纳滨对虾雌性特异性载脂蛋白受体和配体互作模式研究 在转录组中鉴别了肝胰腺型Vg和卵巢型Vg，但是和VgR的结合位点尚不清楚。本研究运用 AlphaFold Ⅱ预测了两种类型的卵黄蛋白及卵黄蛋白受体的 3D 结构，并利用protein-protein docking 分子对接计算并预测了受体与配体的结合位点，其中Vg-H结合位点位于Vitellogenin_N（氨基酸序列1到209号位）结构域，Vg-O结合位点位于LPD_N(氨基酸序列67到594号位)结构域，卵黄蛋白受体存在两处结合域，分别位于LBD1（氨基酸序列93到295号位）和LBD2（氨基酸序列994 到 1332 号位）。运用酵母双杂交技术,受体和配体出现阳性信号，说明两种卵黄蛋白配体基因与卵黄蛋白受体存在互作关系。证明卵黄蛋白通过脂蛋白运输，与卵黄蛋白原受体结合，并在在卵巢发育过程中起重要作用。 综上,甲壳动物存在三种主要脂蛋白，且进化符合生物进化规律。卵巢发育过程中,肝胰腺主要富集载脂蛋白及载脂蛋白受体，且存在两种卵黄蛋白，表达模式不同；卵黄蛋白和卵黄蛋白受体具有互作作用。
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