摘要
动物的毛色是品种的重要特征之一，作为一种可利用的遗传标记，可用于品种鉴定和杂交选育等。家牦牛毛色类型丰富，这为家畜毛色遗传调控提供了很好的研究模型。虽然目前对牦牛毛色的研究已有相关的报道，但是牦牛毛色的遗传基础依旧尚未完全解析。对牦牛毛色遗传基础的解析有助于明晰牦牛适应性进化以及家牦牛毛色的演变，另一方面也有助于牦牛品种的保护。本研究选取环青海湖成年健康黑色、白色和棕色牦牛为研究对象，通过采用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，Hamp;E）染色技术比较分析三种不同毛色牦牛皮肤毛囊结构及色素分布；采用Illumina Hi Seq TM2500测序平台对牦牛的皮肤组织进行转录组测序，筛选与不同毛色相关的差异表达基因；然后利用免疫荧光和Western blot技术对前期通过转录组测序筛选出的候选基因相应的蛋白进行定位定量分析；最后，对通过转录组测序筛选出的与毛色相关基因的SNP位点进行分析。研究结果如下： （1）Hamp;E染色结果显示，黑色、棕色牦牛皮肤组织中有大量黑色素颗粒分布在表皮基底层和毛囊周围，而在白色牦牛皮肤组织表皮基底层和毛囊周围没有发现黑色素颗粒的分布。 （2）对三种不同毛色牦牛皮肤组织转录组测序共获得57.57 Gb Clean Data， Q30在93 %之上。白色牦牛与黑色牦牛皮肤组织差异表达基因426个，其中与毛色相关的基因19个，白色牦牛与棕色牦牛皮肤组织差异表达基因246个，其中与毛色相关的基因16个，黑色牦牛与棕色牦牛皮肤组织差异表达基因4 230个，其中与毛色相关的基因138个。KEGG富集分析结果显示：白色牦牛和黑色牦牛差异基因主要富集在药物代谢-细胞色素P450通路，同时在酪氨酸代谢通路也有富集。白色牦牛和棕色牦牛差异基因主要富集在酪氨酸代谢通路（TYRP1、TYR、ALDH3A1以及AOX4）。黑色牦牛和棕色牦牛差异基因主要富集在是鞘脂代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成以及花生四烯酸代谢通路。Venn图结果显示，三组牦牛中共有9个差异显著基因，与毛色相关的只有SOX10。同时，棕色牦牛SOX10的表达量显著高于黑色和白色牦牛(P＜0.05)，推测SOX10与棕色牦牛毛色形成相关。 （3）免疫荧光染色结果显示，黑色、棕色牦牛皮肤组织表皮基底层和毛囊周围有SOX10蛋白的表达，但在白色牦牛的表皮基底层和毛囊周围未检测到SOX10蛋白的表达。而且黑色牦牛皮肤组织中的SOX10阳性细胞与增殖标记KI67共同定位，表明黑色牦牛SOX10阳性细胞处于活跃状态，但棕色和白色牦牛中未检测到共同定位的细胞；黑色牦牛皮肤组织中，表皮基底层、毛囊周围检测到TYRP1蛋白表达。棕色牦牛皮肤组织中，仅在表皮基底层检测到TYRP1蛋白表达。而白色牦牛皮肤组织中未检到TYRP1蛋白的表达。Western blot结果显示，黑色牦牛皮肤组织SOX10蛋白极显著高于棕色牦牛和白色牦牛(P＜0.01)，棕色牦牛皮肤组织SOX10蛋白极显著高于白色牦牛(P＜0.01)。黑色牦牛皮肤组织TYRP1蛋白极显著高于棕色牦牛和白色牦牛(P＜0.01)，棕色牦牛皮肤组织TYRP1蛋白与白色牦牛差异不显著。 （4）采用转录组测序技术对三种不同毛色牦牛皮肤组的SNP位点进行分析，结果显示，白色牦牛筛选出的8个与毛色相关基因的SNP位点均位于非编码区，而棕色组筛选出的PMEL、ERBB3和PAICS基因的SNP位点引起了氨基酸序列的改变。PMEL编码区107 bp的C＞T突变使得36号的氨基酸序列发生改变，即丝氨酸（serine）变成了亮氨酸（leucine），PMEL编码区1 835 bp的C＞A突变使得612号的丙氨酸（alanine）变为谷氨酸（glutamic），ERBB3编码区3 253 bp的A＞G突变使得1 085号的甲硫氨酸（methionine）变为缬氨酸（valine），将PAICS编码区2 233 bp的C＞T使得745号的脯氨酸（proline）变为丝氨酸（serine）。 通过以上研究结果得出：白色牦牛与棕色牦牛毛色的形成具有不同的调控机制，酪氨酸代谢通路的抑制可能是白色毛色形成的关键因素，TYRP1作为黑色素细胞分化后期的标志，在白色牦牛中未检测到表达，白色牦牛的白色表型可能是由于缺乏分化完全的黑色素细胞；棕色牦牛筛选出的SOX10的1个SNP位点为同义突变，即SNP(1 245 C＞T)；PMEL的2个SNP位点为错义突变，分别为 SNP1(107 C＞T)和 SNP2(1 835 C＞A)；ERBB3的1个SNP位点为错义突变 SNP(3 253 A＞G)；PAICS的1个SNP位点为错义突变SNP(2 233 C＞T)。
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