摘要
放创复合伤因合并放射损伤成为一种迁延难愈的创伤。放创复合伤临床表现为创口细胞坏死、水肿、溃烂，渗出物减少，痒痛难忍，易感染，肉芽组织生机不良，愈合时间延长。而寒冷环境对放创复合伤愈合的影响尚不明确，且没有有效的救治药物。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）可促进细胞生存、增殖、分化、迁移和血管新生，在组织器官再生修复、伤口愈合和防止组织炎症、瘢痕形成等方面发挥着重要作用，因此在治疗难愈性创伤中有广阔的前景。我们实验室前期制备了携带人HGF基因的重组质粒——pHGF，局部注射后能持续表达HGF蛋白。本研究将在前期基础上探究寒冷环境放创复合伤创伤的损伤特点，pHGF对寒冷环境放创复合伤伤口的治疗作用及可能机制，并进一步设计优化并筛选出一种可将pHGF递送至皮肤的优效脂质体。 方法：（1）C57BL/6小鼠经背部致伤、6Gyγ-射线单次全身照射、低温暴露等处理，建立寒冷环境下放创复合伤动物模型，通过观察体重、白细胞（WBC）计数、相对伤口面积、伤口病理改变、羟脯氨酸（HYP）含量、淋巴细胞亚群变化、炎性因子变化、促肾上腺皮质激素（ACTH）和糖皮质激素（GC）含量等指标，研究寒冷环境下放创复合伤的损伤特点。（2）pHGF转染人永生化角质形成细胞（HaCaT），并经20Gy X-Ray照射后24h，检测细胞活力、细胞上清中细胞因子TNF-α和IL-1β含量，采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Nrf2、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白水平，以探究pHGF促进受照HaCaT细胞存活的可能机制。（3）应用寒冷环境放创复合伤动物模型，在创面周围正常组织多点皮下注射pHGF，分低剂量（L-HGF组，50μg/cm2）、中剂量（M-HGF组，100μg/cm2）、高剂量（H-HGF组，150μg/cm2）三组进行给药。造模后观察小鼠的一般状况，在造模后不同时间点称重并拍照记录小鼠伤口愈合情况，检测外周血中WBC、红细胞（RBC）和血小板（PLT）数量、皮肤组织病理学改变、血清中多种细胞因子表达、羟脯氨酸含量、创伤局部皮肤组织中HGF、Nrf2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表达和细胞凋亡情况，以探究pHGF对寒冷环境放创复合伤的治疗作用和可能机制。（4）采用逆相蒸发制备了4种不同的脂质体，通过丁达尔效应、包封效果检测、转染效率、细胞活性检测、脂质体-复合物形态观察、粒径测定等方法筛选转染效率高且细胞毒性低，适合皮肤转染的脂质体。 结果：（1）C57BL/6小鼠在经寒冷环境放创复合伤造模后，伤照组和伤照冻组小鼠体重及WBC计数明显下降，至造模后21d，伤照组体重与单伤组无明显差异，但伤照冻组小鼠体重及WBC计数仍显著低于单伤组。造模后不同时间点，伤照冻组相对伤口面积均大于单伤组和伤照组，7d时明显大于伤照组。病理检测结果显示造模后21d，单伤组、伤冻组和伤照组均出现皮肤附件，而伤照冻组表皮增厚，组织结构仍未恢复。造模后伤照组和伤冻组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞比例变化明显，14d时伤照组CD4/CD8比值与单伤组相比无明显差异，而伤照冻组CD4/CD8比值明显升高。致伤后伤照冻组IL-6、IL-2、IL-13、TNF-α和IFN-γ水平增高，IL-4水平降低，炎症反应延长。GC水平增高，ACTH水平降低。（2）HaCaT细胞经20Gy照射后，细胞活力明显降低，细胞上清中TNF-α和IL-1β含量明显增高，Nrf2和Bcl-2的mRNA和蛋白水平降低，Bax的mRNA和蛋白水平升高。而转染了pHGF的HaCaT细胞经照射后，与20Gy组相比，细胞活性明显增加，细胞上清中TNF-α和IL-1β含量显著降，细胞中Nrf2和Bcl-2的mRNA和蛋白水平显著升高，Bax/Bcl-2比值明显降低。（3）pHGF给药治疗后，各给药组小鼠体重均有所增加，H-HGF组小鼠致伤后体重恢复明显，至21d小鼠体重与单伤组相当，且7d后WBC计数有所上升且高于模型组。给药后3d和7d，H-HGF组小鼠相对伤口面积明显减少，至14d创面完全闭合。病理检测结果显示，各给药组21d表皮变薄并有皮肤附属器出现。各给药组小鼠血清中IL-6、IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α及IFN-γ等含量明显降低，IL-4含量明显升高，炎症反应受抑。各给药组HYP含量在7d时均有明显升高，与单伤组升高时间一致。免疫组化结果显示pHGF给药后7d，M-HGF和H-HGF组小鼠的创伤局部高表达HGF蛋白，且Nrf2、VEGF和Bcl-2蛋白表达均显著高于模型组，Bax表达低于模型组。TUNEL结果显示，给药后3d，各给药组细胞凋亡显著减少。（4）通过逆相蒸发法制备的4种脂质体均可出现丁达尔效应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，体积/质量比≥3时，脂质体可完全包裹质粒DNA。细胞转染结果显示，4种脂质体均可转染HEK293细胞和HaCaT细胞，体积/质量比=3时，转染效率最高。DOTAP/DOPE/MPEG2000-DSPE脂质体对细胞活性基本无影响，脂质体比例越大，细胞毒性越大。扫描电镜和粒径检测结果显示，DOTAP脂质体-pHGF复合物呈圆形或椭圆形，粒径约为130-170nm。 结论：建立了寒冷环境放创复合伤动物模型，其创面比放创复合伤更为难愈。pHGF重组质粒可在创面局部持续表达HGF蛋白，有效促进寒冷环境放创复合伤小鼠创面愈合，其机制可能是pHGF可通过调节Nrf2，促进Bcl-2和VEGF表达，抑制炎症反应和细胞凋亡，促进血管生成和胶原合成，多因素协同促进寒冷环境放创复合伤小鼠创面愈合。制备获得了低毒、转染效率高的DOTAP/DOPE/MPEG2000-DSPE脂质体更有利于pHGF的皮肤递送。综上，pHGF基因治疗为寒冷环境放创复合伤等难愈性创伤的治疗提供了新的治疗思路。
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