摘要
目的： 观察柴胡疏肝散(chaihu shugan powder,CSP)改善肝郁型代谢综合征(metabolic syndrome,MS)小鼠胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的效应;阐明肝X受体α(liver X receptor α,LXRα)在肝郁型MS小鼠肝组织及高糖高胰岛素诱导的肝细胞IR模型微环境中的改变;确证miRNA-613/LXRα信号通路在CSP改善IR,调节机体整体代谢中的调控作用，验证中医辨证分型论治的有效性与科学性。 方法： 研究内容一：体内实验探究CSP对肝郁型MS小鼠肝郁症状及糖脂代谢的影响，验证CSP对MS中心病理改变环节即IR的作用。采用高脂高糖饲料喂养16周结合慢性束缚应激2周构建肝郁型MS小鼠模型，以阿托伐他汀钙片与二甲双胍为阳性对照药，CSP临床给药剂量为中剂量(CSPM),其二分之一为低剂量(CSPL),其二倍为高剂量(CSPH),观察CSP各剂量组对肝郁型MS小鼠一般状态、糖水摄取、体重、内脏脂肪、肝脏质量、血脂谱、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)、胰岛素耐量实验(insulin resistance test,ITT)等生理生化指标的影响;H&E染色及油红O染色观察肝脏病理改变;Western blot检测肝脏组织蛋白中胰岛素信号通路蛋白：胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)、丝氨酸磷酸化307位点的胰岛素受体底物 1(phosphorylation of IRS-1 at serine 307,p-IRS-1Ser307)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine-protein kinase,Akt),丝氨酸磷酸化473位点的丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphorylation of Akt at serine 473,p-AktSer473)的表达水平。 研究内容二：高糖(33.3mM)与高胰岛素(100nM)干预小鼠原代肝细胞与人肝细胞体外诱导肝细胞IR模型，观察并评价不同浓度CSP含药血清对肝细胞IR模型的作用。根据干预条件将细胞分为Con组、IR组、2.5％、5％与10％CSP含药血清组，通过油红O染色检测各组肝细胞脂滴沉淀、流式检测各组肝细胞对葡萄糖摄取能力的改变，Western blot检测各组肝细胞中胰岛素信号通路p-IRS-1Ser307、IRS-1、p-AktSer473、Akt 蛋白表达水平。 研究内容三：质谱结合网络药理学分析预测CSP对IR的关键作用靶点。ELSA检测肝组织与肝细胞中游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)与二酰基甘油(diacyl glycerol,DAG)的含量。使用免疫组化、荧光染色及Western blot等实验技术检测体内外各组肝组织与肝细胞中调控脂肪酸合成信号通路LXRα/固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1,SREBP-1)表达水平，及其下游脂肪酸从头合成限速酶：脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)与乙酰辅酶 A 羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)的改变。 研究内容四：应用转基因技术体外将LXRα沉默的质粒（sh-LXRα）及相应空白质粒（sh-NC）转染入肝细胞IR模型中，阻断LXRα在肝细胞IR模型中的表达，并对转染后肝细胞进行油红O染色及2-NBDG检测;揭示LXRα沉默时对肝细胞IR模型中脂滴沉淀及IR的影响。随即，向10％ CSP组加入LXRα激动剂T091317,检测细胞中FFA与DAG的含量，细胞对葡萄糖的摄取能力，及细胞中脂肪酸合成相关蛋白LXRα、SREBP-1、FASN、ACC及胰岛素信号通路相关蛋白p-IRS-1Ser307、IRS-1、p-AktSer473及Akt的表达水平。探究CSP改善IR的作用是否通过抑制LXRα/SREBP-1信号传导，减少肝细胞脂肪酸从头合成实现。 研究内容五：探究CSP能否通过调控miR-613/ LXRα信号通路抑制肝细胞脂肪酸从头合成改善IR。使用TargetScan数据库预测与LXRα结合的miRNA,并通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）与双荧光素酶报告基因实验进行验证，同时分别向人肝细胞中转染miR-613类似物（miR-613m）和抑制物（miR-613i）,并检测LXRα/SREBP-1信号通路蛋白与胰岛素信号通路IRS-1/Akt蛋白表达水平。 结果： 研究内容一：Model组小鼠神态萎靡，行动缓慢迟钝，且对糖水偏好率明显降低（P＜0.050）,Model组小鼠表现肝郁症状;Model组小鼠体形、体重、内脏脂肪、肝重、血清中TG、TC、LDL-C、FBG及肝脏中TC、TG水平均显著升高（P＜0.050）,同时Model组小鼠IPGTT与ITT的AUC面积也显著高于Control组（P＜0.050）,小鼠表现MS症状;CSP给药后，小鼠精神恢复，行动较灵活，且对糖水偏好度增加，与Model组比较有统计学差异（P＜0.050）,相较于Model组，CSP给药组小鼠体重、内脏脂肪与肝重增重受抑，血清与肝脏中TG、TC降低，且以CSPH组最为明显（P＜0.050）;且CSP给药干预后小鼠FBG、IPGTT与ITT值均显著降低，以CSPH组改变最为显著（P＜0.050）。Western blot结果显示，相较Control组，Model组肝组织蛋白中p-IRS-1Ser307升高而p-AktSer473水平降低（P＜0.050）;CSP给药后能逆转上述蛋白表达水平，且以CSPH组作用最佳（P＜0.050）,提示CSP给药后可有效改善肝郁型MS小鼠肝郁症状与糖脂代谢症状，对IR有显著改善作用，且CSPH作用最佳。 研究内容二：小鼠原代肝细胞与人肝细胞IR模型中脂滴沉淀明显，2-NBDG荧光强度均显著减弱（P＜0.050）,CSP含药血清给药后肝细胞IR模型中脂滴减少，而细胞中2-NBDG的荧光强度显著增加，且以10％ CSP组表现最为明显（P＜0.050）;此外，相较于Con组，IR组p-IRS-1Ser307的蛋白表达明显增加（P＜0.050）,而p-AktSer473的蛋白表达明显减少（P＜0.050）;CSP含药血清给药后可逆转此趋势，且以10％CSP组作用最为明显（P＜0.050）。提示CSP干预后可有效地改善肝细胞IR模型中脂滴沉淀与IR。 研究内容三：结合质谱与网络药理学分析，获得21种CSP主要活性成分，并对活性成分作用的244个基因靶点进行富集分析，结果显示CSP作用基因靶点与糖脂代谢疾病相关基因显示高度相关性，制作CSP-IR蛋白互作网络，结果显示脂肪酸从头合成信号通路基因SREBPF是其中的关键作用基因。对肝组织与肝细胞中FFA与DAG含量及调控脂肪酸从头合成的相关因子表达水平进行检测，发现Model组小鼠肝脏组织与体外肝细胞IR模型中FFA与DAG含量均显著增加（P＜0.050）,CSP可有效降低体内Model组小鼠肝组织与体外肝细胞IR模型中FFA与DAG含量（P＜0.050）。此外，Model组小鼠肝脏组织与体外肝细胞IR模型中LXRα、SREBP-1、FASN、ACC表达均明显增加（P＜0.050）,而CSP干预可有效抑制上述因子蛋白表达（P＜0.050）。 研究内容四：向人肝细胞IR模型中转染sh-LXRα后，细胞中脂滴数量与大小明显减少并变小，细胞对葡萄糖的摄取能力增强（P＜0.050）,提示LXRα可直接影响肝细胞IR模型中脂质合成与IR。向10％CSP组中加入LXRα激动剂T091317后发现，与10％CSP组比较，T091317+10％CSP组细胞中FFA、DAG含量及脂滴的沉淀均显著增加（P＜0.050）;T091317+10％CSP组细胞中脂肪酸合成信号通路LXRα/SREBP-1蛋白水平也显著增加（P＜0.050）。此外，T091317减弱10％ CSP组细胞对葡萄糖的摄取并抑制CSP改善胰岛素通路IRS-1/Akt信号传导的作用（P＜0.050）。提示LXRα是CSP抑制肝细胞IR模型脂肪酸合成进而改善IR的主要作用靶点。 研究内容五：结合生物信息学分析与双荧光素酶基因报告实验验证miR-613与NR1H3（LXRα）的3''-UTR存在结合位点;转染miR-613m后可抑制肝细胞IR模型中脂肪酸合成蛋白表达，且改善胰岛素通路信号传导（P＜0.050）。 结论： 高脂高糖饲养16周结合慢性束缚应激2周制备的肝郁型MS小鼠表现为肝郁、糖脂代谢紊乱与IR等的病理改变。CSP给药后能有效地改善肝郁型MS小鼠上述症状。同时，CSP含药血清能有效地改善体外高糖高胰岛素诱导的肝细胞IR模型中脂肪酸从头合成与胰岛素抵抗。肝细胞IR模型中miR-613表达降低而LXRα表达增加，调控脂肪酸合成通路LXRα/SREBP-1被激活，肝细胞中FFA与DAG含量增加，胰岛通路IRS-1/Akt信号传导受阻，细胞表现IR。CSP通过调控miR-613/LXRα通路，抑制肝细胞IR模型脂肪酸从头合成，改善IR。
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