摘要
目的: 本研究旨在通过建立创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)大鼠模型，观察补肾填精方药龟鹿二仙胶(GLEXJ)抗PTSD恐惧记忆异常的效应;基于海马γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能(GABAergic)系统，探讨补肾填精法调节PTSD大鼠恐惧记忆的作用机制。 方法: 1.设置正常对照组(Control组)、模型组(PTSD组)、龟鹿二仙胶组(GLEXJ组)和帕罗西汀组(PRX组);采用足底电击作为应激源建立PTSD大鼠模型。 2. 采用高架十字迷宫(Elevated plus maze,EPM)检测大鼠的焦虑水平;采用恐惧条件反射系统进行场景恐惧记忆提取、恐惧泛化、消退训练和消退保留测试实验。 3. 采用Elisa检测大鼠海马GABA和谷氨酸(glutamic acid,Glu)的含量;采用Western blot技术检测海马GABA的合成酶，即谷氨酸脱羧酶67(glutamate decarboxylase 67,GAD67)蛋白表达的变化;以GAD67为GABAergic中间神经元的分子标签，采用免疫荧光技术检测GABAergic中间神经元数目变化。 4.设置阴性对照组(AAV-Control)、海马GAD67敲减组(AAV-GAD67-RNAi)和龟鹿二仙胶组(AAV-GAD67-RNAi + GLEXJ);采用在体腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)RNA干扰技术敲减海马GAD67;采用免疫荧光技术检测AAV转染情况和GAD67敲减效果;采用恐惧条件反射系统进行场景恐惧条件化训练、恐惧记忆提取、恐惧泛化、消退训练和消退保留测试实验。 5. 设置溶剂对照组(Veh组)和Salubrinal组(Sal组);使用工具药Salubrinal抑制内质网应激(Endoplasmic reticulunm stress,ERS)PERK通路;采用足底电击作为应激源建立PTSD大鼠模型;采用高架十字迷宫和恐惧条件反射系统检测Salubrinal对PTSD大鼠焦虑样行为和恐惧记忆的影响。 6. 采用Western blot技术检测Salubrinal对PTSD大鼠海马GAD67蛋白表达量的影响;采用免疫荧光技术检测Salubrinal对PTSD大鼠海马GABAergic中间神经元数目的影响;采用Western blot技术检测Salubrinal对PTSD大鼠海马GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP和Caspase12蛋白表达的影响;采用免疫荧光双标技术检测Salubrinal对PTSD大鼠海马GABAergic中间神经元的GRP78、p-PERK、CHOP和Caspase12表达的影响。 7.采用Western blot技术检测补肾填精法对PTSD大鼠海马GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP和Caspase12蛋白表达的影响;采用免疫荧光双标技术检测补肾填精法对PTSD大鼠海马GABAergic中间神经元的GRP78、p-PERK、CHOP和Caspase12表达的影响。 8. 采用Western blot技术检测补肾填精法对PTSD大鼠海马GABA转运体(GABA transporter,GAT)和囊泡型 Glu 转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUT)的影响，包括囊泡型 GABA 转运蛋白(vesicular GABA transporter,VGAT)、GAT-1、GAT-3 和 VGLUT1。 结果: 1.补肾填精法改善PTSD大鼠焦虑样行为 与Control组相比，PTSD组在高架十字迷宫中的总路程、开臂路程百分比、开臂滞留时间百分比和开臂进入次数百分比明显减少（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组在高架十字迷宫中的总路程无显著差异（P＞0.05）,开臂路程百分比、开臂滞留时间百分比和开臂进入次数百分比明显增加（P＜0.05）;与PTSD组比较，PRX组在高架十字迷宫中的总路程和开臂进入次数百分比无显著改变（P＞0.05）,开臂路程百分比和开臂滞留时间百分比明显增加（P＜0.05）。 2.补肾填精法调节PTSD大鼠场景恐惧记忆 （1）恐惧记忆提取:与Control组比较，PTSD组的不动时间百分比显著增加（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组的不动时间百分比无显著改变（P＞0.05）,PRX组的不动时间百分比无显著改变（P＞0.05）。 （2）恐惧记忆泛化测试:与Control组比较，PTSD组在场景B中的不动时间百分比显著增加（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组在场景B中的不动时间百分比和鉴别指数B/A显著降低（P＜0.05）;与PTSD组比较，PRX组在场景B中的不动时间百分比和鉴别指数B/A无显著改变（P＞0.05）。 （3）消退保留测试:与Control组比较，PTSD组的不动时间百分比显著增加（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组的不动时间百分比显著降低（P＜0.05）,PRX组的不动时间百分比无显著改变（P＞0.05）。 3.补肾填精法对PTSD大鼠海马GABA、Glu含量和Glu/GABA比值的影响 与Control组比较，PTSD组海马中的GABA和Glu含量显著减少（P＜0.05）,Glu/GABA比值显著升高（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组GABA含量明显增加（P＜0.05）,Glu含量无显著差异（P＞0.05）,Glu/GABA比值明显下降（P＜0.05）;与PTSD组比较，PRX组GABA、Glu含量和Glu/GABA比值均无显著差异（P＞0.05）; 4.补肾填精法对PTSD大鼠海马GAD67蛋白表达和GABAergic中间神经元数目（GAD67阳性细胞数目）的影响。 （1）与Control组比较，PTSD组海马GAD67蛋白表达量显著减少（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组海马GAD67蛋白表达量明显增加（P＜0.05）,PRX组海马GAD67蛋白表达量无显著变化（P＞0.05）; （2）与Control组比较，PTSD组海马CA1和CA3区的GABAergic中间神经元数目显著减少（P＜0.05）;与PTSD组比较，GLEXJ组海马CA1区的GABAergic中间神经元数目明显更多（P＜0.05）,CA3区的GABAergic中间神经元数目无显著差异（P＞0.05）;与PTSD组比较，PRX组海马CA1和CA3区的GABAergic中间神经元数目无显著变化（P＞0.05）;Control组、PTSD组、GLEXJ组和PRX组海马DG区中的GABAergic中间神经元数目无显著差异（P＞0.05）。 5.敲减海马CA1区的GAD67对大鼠恐惧记忆的影响及补肾填精法的干预作用 6.抑制内质网应激PERK通路对PTSD大鼠焦虑样行为和恐惧记忆的影响 7.抑制内质网应激PERK通路对PTSD大鼠海马GABAergic中间神经元以及PERK通路相关蛋白的影响 8.补肾填精法对PTSD大鼠海马PERK通路相关蛋白的影响 9.补肾填精法对PTSD大鼠海马GABA和Glu相关转运蛋白的影响 结论: 1. PTSD大鼠表现出明显焦虑样行为和严重的恐惧记忆异常。补肾填精治法代表方GLEXJ能明显改善PTSD大鼠的焦虑，并减轻恐惧泛化和消退保留障碍。 2.PTSD大鼠海马GABA和Glu含量下降，Glu/GABA比值升高，GAD67蛋白表达量下降以及GABAergic中间神经元减少。GLEXJ能够通过增加GABA含量，降低Glu/GABA比值，增加GAD67蛋白表达，保护CA1区中的GABAergic中间神经元以调节海马兴奋/抑制失衡。海马GABAergic中间神经元在调节恐惧记忆中发挥关键作用。GABAergic中间神经元是补肾填精方龟鹿二仙胶发挥调节恐惧记忆作用的一个重要的潜在靶点。 3.内质网应激PERK通路参与了 PTSD大鼠海马GABAergic中间神经元的损伤，龟鹿二仙胶能够通过下调PERK通路的部分蛋白表达发挥保护GABAergic中间神经元的作用。 4. PTSD大鼠海马GAT-1表达增加，龟鹿二仙胶能够下调GAT-1表达以调节海马兴奋/抑制失衡。
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