摘要
癌症是 21 世纪人类的主要死因之一。目前癌症的治疗手段主要是手术、放疗和化疗。但是现有的抗癌药物一般难以自主进入肿瘤细胞，导致化疗的效果不甚理想。为解决抗癌药物的跨膜问题，同时提高给药系统的靶向性，可活化细胞穿膜肽（ACPPs）应运而生。ACPPs 是由细胞穿膜肽（CPPs）、连接肽与聚阴离子肽连接组成的三域肽。在ACPPs 的设计中，CPPs的正电性最初通过静电结合被聚阴离子掩盖，而在对基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9 ）敏感的连接肽PLGLAG被切割后，CPPs被“激活”，从而带着负载的药物分子进行下一步的细胞跨膜。虽然ACPPs在实验中体现出良好的肿瘤靶向性，但是ACPPs被肿瘤组织高表达的 MMP-2/9 激活从而释放出 CPPs 及其负载药物的详细过程与分子机制目前尚未清楚。 近年来，分子动力学模拟等计算化学方法成为阐明生物体中酶的化学性质以及设计新型治疗剂的必要工具。本工作希冀通过分子动力学模拟方法研究MMP-2/9与ACPPs的相互作用与分子识别机制，使用基于经典力学和量子力学的QM/MM方法探究MMP-2/9水解底物肽的具体过程，采用操纵式分子动力学模拟方法和伞状取样法计算自由能探索 ACPPs 水解产物的释放机制。本论文希望通过对MMP-2/9激活ACPPs具体过程的系统研究，为靶向给药系统的设计提供分子水平上的深入理解。 首先，本文对底物肽及ACPPs与MMP2-/9的结合过程进行了探究。在底物肽PLGLAG，即ACPPs的连接肽与MMP-9催化域的结合中，底物肽P1位点的Gly4和P1’位点的Leu5被证实是影响结合稳定性的关键残基。通过突变研究，发现底物肽P1位点的位置，而非其残基种类，在底物肽与 MMP-9催化域的结合中起关键作用。在探索 ACPPs 与 MMP-2/9 的结合时，发现 E9-PLGLAG-R9 （E9R9）能够被MMP-2/9成功识别并结合，并且R9与MMP-2/9的相互作用小于E9与MMP-2/9的相互作用，符合后续屏蔽效应顺利解除的条件。但是反向结合的R9E9与MMP-9的结合则没有E9R9稳定，其结合情况也不利于后续屏蔽效应的解除。本论文还探究了不同电荷量和不同长度的ACPPs对MMP-9识别底物肽过程的影响，研究发现底物肽与MMP-9结合的强弱与稳定性都会受到一定程度的影响。因此从识别与结合的角度来看，E9R9是最为合适的ACPPs。 随后，我们对ACPPs激活过程中的关键一步——MMP-2/9水解底物肽的过程进行了深入的探究。研究发现MMP-2和MMP-9水解底物肽PLGLAG的催化机制均是水介导的亲核进攻。水分子不仅介导水解反应的发生，而且起到了稳定中间体的作用。此外，催化锌离子附近的谷氨酸（ MMP-2: Glu116 ， MMP-9: Glu227）通过帮助极化催化水分子Wat以及帮助质子转移，从而在整个催化水解反应中发挥了重要作用。比较两种蛋白酶水解底物肽PLGLAG的能量变化，发现MMP-2水解底物肽PLGLAG的效率更高，并且MMP-2水解体系的决速步为反应第一步亲核进攻，而MMP-9水解体系的决速步则是反应第二步氢键重排。本文对底物肽 P1 和 P1’位点的突变结果表明，不同残基种类会改变关键步骤的反应能垒，从而改变反应的决速步，同时影响底物肽的水解速率。 之后，本文还探究了底物肽及 ACPPs 水解产物的释放机制。底物肽断裂后的氨基部分 N-product 与其酰基部分 C-product 解离常数的巨大差异，说明N-product 比C-product 更易离开靶蛋白MMP-9。底物肽水解产物 P1位点残基种类的改变会对解离常数产生巨大的影响，P1位点突变为带负电的天冬氨酸时，更有利于屏蔽效应的解除。ACPPs水解后的CPPs端产物N-R9的离去主要需要克服与屏蔽肽端水解产物的相互作用，水解后的N-R9基本与MMP-9没有结合。而ACPPs水解后的屏蔽肽端产物C-E9与靶蛋白MMP-9以及CPPs端水解产物均存在很强的相互作用，因此 C-E9 在释放过程中首先要完成连接肽 P1 位点残基与MMP-9催化锌离子的解离，其次再是屏蔽肽段部分E9与CPPs部分R9的解离。因此在ACPPs水解后，CPPs端水解产物会比屏蔽肽端水解产物更易离开靶蛋白MMP-9，从而完成ACPPs的激活过程，为下一步CPPs及负载药物进入靶细胞做好准备。 本论文探究了MMP-2/9结合ACPPs的识别机制，MMP-2/9水解ACPPs连接肽的催化机制，以及ACPPs水解产物的释放机制，系统性地阐述了MMP-2/9激活 ACPPs 的分子机制。希望本论文的工作能够为基于 MMP-2/9 的新一代ACPPs靶向给药系统的设计提供理论基础与指导。
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