摘要
目的: 鉴于肥胖过程中伴随着外周组织的糖脂代谢絮乱和中枢神经系统的炎症反应，在这项研究中，我们建立高脂饮食(High-fat Diet,HFD)诱导的肥胖模型，初步探讨DSS对肥胖的治疗作用及作用机制。 方法: 实验一:下丘脑小胶质细胞Sirt6应答营养环境改变:(1)将小鼠随机分为3组:正常饮食组、HFD4周组和HFD8周组，每组6只。正常饮食组小鼠喂食正常饮食饲料，HFD组小鼠喂食高脂饲料。研究结束时，对小鼠进行心脏灌注，取全脑，免疫荧光检测小鼠下丘脑小胶质细胞Sirt6的表达。(2)将小鼠随机分为2组:正常饮食组和HFD24周组，每组6只。正常饮食组小鼠喂食正常饮食饲料，HFD组小鼠喂食高脂饲料。研究结束时，分离小鼠脑组织小胶质细胞，荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)检测小鼠小胶质细胞Sirt6 mRNA的表达水平。(3)取新生24h的小鼠，分离培养原代小胶质细胞，使用油酸(Oleic Acid,OA)和棕榈酸(Palmitic Acid,PA)联合处理24h,Western blot检测原代小胶质细胞Sirt6的蛋白表达水平。(4)在BV2细胞中，使用OA&PA联合处理12 h或24h,检测BV2细胞Sirt6 mRNA和蛋白的表达水平。 实验二:Sirt6改善OA&PA联合处理诱导的BV2细胞炎症反应:(1)在BV2细胞中，腺病毒转染过表达Sirt6,使用OA&PA联合处理24 h,免疫荧光检测BV2细胞 CD68 和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的表达。(2)在 BV2细胞中，腺病毒转染过表达Sirt6,使用OA&PA联合处理24h,qPCR检测BV2细胞TNF-α、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)mRNA的表达。(3)在BV2细胞中，腺病毒转染过表达Sirt6,使用OA&PA联合处理24h,酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测细胞培养基中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。 实验三:下丘脑小胶质细胞Sirt6参与HFD诱导肥胖的调节:将SIRT6flox/flox小鼠(以下简称SIRT6fl/fl小鼠)与Cx3cr1-Cre小鼠杂交产生小胶质细胞Sirt6条件性敲除小鼠(以下简称SIRT6Mic-/-小鼠)。取SIRT6fl/fl小鼠(6-8周龄)和SIRT6Mic-/-小鼠(6-8周龄)进行12周的HFD。另取相同周龄的SIRT6fl/fl小鼠和SIRT6Mic-/-小鼠进行正常饮食，作为正常饮食对照。每周记录小鼠的体重;HFD结束后，利用CT扫描成像重建小鼠的皮下脂肪组织(Inguinal White Adipose Tissue,iWAT)和附睾脂肪组织(Epididymal White Adipose Tissue,eWAT);苏木素-伊红(Haematoxylin-Eosin,HE)染色观察小鼠肝脏、iWAT、eWAT和棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)的形态;油红O染色观察小鼠肝脏脂质积累;免疫荧光染色检测小鼠下丘脑ibal的表达;qPCR检测小鼠下丘脑炎症细胞因子Tnf-a、Il-6和Il-1βmRNA的表达水平。 实验四:DSS对HFD诱导肥胖小鼠糖脂代谢和下丘脑炎症的影响:将小鼠随机分为5组:正常饮食组、HFD组、盐酸吡格列酮组、DSS低剂量组和DSS高剂量组，每组16只。正常饮食组小鼠喂食正常饮食饲料，HFD组小鼠喂食高脂饲料。采取造模给药同时进行的方式，DSS低剂量组和DSS高剂量组给药剂量分别为3.2 g·kg-1·d-1和6.4 g·kg-1·d-1,盐酸吡格列酮组给药剂量为10mg·kg-1·d-1,对照组和模型组按10 ml·kg-1·d-1 生理盐水灌胃，所有小鼠连续给药12周。每周记录小鼠的体重;HFD结束后，对所有的小鼠进行葡萄糖耐受试验(Glucose Tolerance Test,GTT)、胰岛素耐受试验(Insulin Tolerance Test,ITT)和丙酮酸耐受试验(Pyruvate Tolerance Test,PTT);利用CT扫描成像重建小鼠的iWAT和eWAT;HE染色观察小鼠肝脏、iWAT、eWAT和BAT的形态;油红O染色观察小鼠肝脏脂质积累;免疫荧光染色检测小鼠下丘脑ibal以及Sirt6的表达;Elisa检测小鼠下丘脑炎症细胞因子Tnf-a、Il-6和Il-1β的表达水平。 结果: 实验一:下丘脑小胶质细胞Sirt6应答营养环境改变。(1)与正常饮食组小鼠相比，HFD8周组小鼠下丘脑小胶质细胞Sirt6的表达轻度降低。(2)与正常饮食组小鼠相比，HFD 24周组小鼠小胶质细胞Sirt6 mRNA的表达降低。(3)OA&PA联合处理诱导新生小鼠小胶质细胞Sirt6的蛋白表达水平降低。(4)OA&PA联合处理诱导BV2细胞Sirt6 mRNA和蛋白的表达降低。 实验二:Sirt6过表达改善OA&PA联合处理诱导的BV2细胞炎症反应。（1）OA&PA联合处理24 h显著增加BV2细胞CD68和TNF-α的表达，Sirt6过表达显著降低BV2细胞CD68和TNF-α的表达。（2）OA&PA联合处理24 h显著增加BV2细胞Tnf-a、Il-6和Il-1β mRNA的表达，Sirt6过表达显著降低BV2细胞Tnf-a、Il-6和Il-1βmRNA的表达。（3）OA&PA联合处理24h显著增加BV2细胞培养基中炎症细胞因子TNF-a、IL-6和IL-1 β的表达，Sirt6过表达显著降低培养基中TNF-a、IL-6和IL-1 β的表达。 实验三:下丘脑小胶质细胞Sirt6参与HFD诱导肥胖的调节。（1）小胶质细胞Sirt6敲除加剧HFD诱导的肥胖。在正常饮食中，小胶质细胞Sirt6敲除小鼠的体重略有增加，但差异可以忽略不计。类似地，小鼠iWAT、eWAT和BAT的重量略有增加，但差异可以忽略不计。然而，脂肪组织的HE染色结果显示，小胶质细胞Sirt6敲除导致小鼠iWAT的细胞形态肥大。在HFD中，小胶质细胞Sirt6敲除加剧HFD小鼠体重的增加和脂肪组织的积累。与SIRT6fl/fl 组小鼠相比，SIRT6Mic-/-组小鼠体重显著增加。与SIRT6fl/fl组小鼠相比，SIRT6Mic-/-组小鼠的脂肪组织显著增加，这通过iWAT和eWAT的MicroCT图像，iWAT、eWAT和BAT的重量，以及iWAT、eWAT和BAT的HE染色结果得到证实。此外，与SIRT6fl/fl组小鼠相比，SIRT6Mic-/-组小鼠的肝重比略有增加，但差异没有统计学意义。肝脏HE染色结果显示，SIRT6Mic-/-小鼠表现出加剧的气球样变。进一步，肝脏油红O染色结果显示，SIRT6Mic-/-小鼠表现出更多的肝脏脂质累积和更严重的肝脏脂肪变性。（2）小胶质细胞Sirt6敲除加剧HFD小鼠的下丘脑炎症反应。在正常饮食中，免疫荧光染色结果显示，SIRT6fl/fl小鼠和SIRT6Mic-/-小鼠下丘脑ARC区域中没有观察到小胶质细胞数量和细胞形态的显著差异。此外，qPCR结果显示，SIRT6fl/fl小鼠和SIRT6Mic-/-小鼠下丘脑炎症细胞因子Tnf-α、Il-6和Il-1βmRNA的表达水平没有显著差异。在HFD小鼠中，免疫荧光染色结果显示，小胶质细胞Sirt6条件性敲除加剧HFD小鼠下丘脑的小胶质细胞活化。此外，与SIRT6fl/fl组小鼠相比,SIRT6Mic-/-组小鼠下丘脑中 Tnf-α、Il-6和Il-1βmRNA的表达水平显著增加。 实验四:DSS改善HFD小鼠的肥胖和下丘脑炎症反应。DSS降低HFD小鼠的体重，改善HFD小鼠的脂质累积和血脂。 结论: (1)下丘脑小胶质细胞Sirt6参与HFD诱导肥胖的调节，小胶质细胞Sirt6敲除加剧 HFD诱导的肥胖。此外，小胶质细胞Sirt6敲除加剧HFD小鼠下丘脑ARC区域小胶质细胞的活化和下丘脑的炎症反应。鉴于Sirt6具有减少炎症反应从而保护小胶质细胞的能力，我们认为Sirt6可以被视为防止小胶质细胞受到HFD诱导的损伤的保护物。因此，小胶质细胞Sirt6可能是肥胖的重要治疗靶点。 (2)DSS改善HFD小鼠的肥胖。DSS降低HFD小鼠的体重，改善HFD小鼠的脂质累积和血脂。其次，DSS改善HFD诱导肥胖相关的病理损伤，降低小鼠的葡萄糖耐量受损，减轻小鼠的胰岛素抵抗和减少小鼠的肝脏糖异生水平。此外，DSS增加HFD小鼠下丘脑ARC区域小胶质细胞Sirt6的表达，减轻HFD小鼠下丘脑的炎症反应。基于小胶质细胞Sirt6对饮食诱导的肥胖具有保护作用，我们认为DSS增加小胶质细胞Sirt6的表达对高脂饮食诱导的肥胖可能具有至关重要的作用，其可能通过改善下丘脑小胶质细胞活化和减轻下丘脑炎症反应，进而改善饮食诱导的肥胖。
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