摘要
目的: 毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)有2000多年的药用应用历史，而其地上部分尤其是芍药花的相关研究甚少。芍药花具有通经活络、养血柔肝功效，其药用及保健价值逐渐被重视。本文选取同一试验田的4个芍药花品种为研究对象，基于液相色谱-质谱(LC-MS)联用分析技术对芍药花化学成分进行系统性分析，完善芍药花的化学成分信息，并对不同原产地芍药花进行差异性分析，并评价不同产地来源、不同花朵部位提取物抗氧化及抗炎能力强弱，为芍药花的药效物质基础研究及其功效产品的开发与应用提供实验依据。 方法: 1.芍药花的化学成分分析 建立UHPLC-QE Orbitrap MS方法，对芍药花样本的次生代谢产物进行质谱数据采集。液相部分:采用色谱柱 Waters ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm),流动相0.1 ％甲酸水(A)和乙腈(B)进行实验。洗脱程序为:90 ％ A(0-1 min),90-82 ％ A(1-3 min),82-68 ％ A(3-6 min),68-54 ％ A(6-8.5 min),54-50 ％ A(8.5-10 min),50-10 ％ A(10-13 min),10 ％ A(13-15 min),10-90 ％ A(15-17 min),90 ％ A(17-19 min)。实验时流速为0.2 mL/min,进样量为2μL。 质谱部分:采用加热型电喷雾离子源(HESI),采用全扫描(Full scan)和二级扫描(DD-MS2)两种扫描模式在正负离子模式下分别采集，两种扫描模式的分辨率分别设置为35000(+)、17500(-),扫描范围为m/z 100-1200,碰撞能量为35,离子喷雾电压为 4200 V(+)、3700 V(-);鞘气，40 psi(+)/45 psi(-);辅助气，15 psi;毛细管温度，350℃。根据所采集所得的高分辨率一、二级质谱数据，通过与对照品比对、参考相关文献并结合特征化合物的特征裂解规律对芍药花的化学成分进行定性分析。 2.化学成分差异比较 采用绝对定量与相对定量相结合的方法，对69个峰型、峰强度好的化合物进行定量分析。并通过福林酚(Folin-Ciocalteu)法、NaNO2-Al(NO3)3法、pH示差法分别测定芍药花各部位总多酚、总黄酮、总花色苷含量。 3.抗氧化及抗炎活性对比 分别采用FRAP法、ABTS法、DPPH法、ORAC法测定11种样品(芍药花各部位)提取物的抗氧化能力。以Trolox当量表示单体化合物的抗氧化能力。使用spearman相关性计算方法对芍药花各部位总多酚、总黄酮、总花色苷含量与抗氧化能力进行相关性分析。通过MTT法检测不同提取物对细胞存活率的影响，优选适宜浓度进行后续实验。使用Griess法检测11种提取物的高、中、低浓度对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞外NO含量的影响。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定不同提取物对LPS诱导的炎症细胞白细胞介素6(IL-6)、TNF-α的分泌水平的影响。 结果: 1.共鉴定芍药花145种化学成分，包含没食子酸衍生物26个、花色苷16个、黄酮类化合物70个、萜类化合物17个、酚酸类化合物16个。 2.大多数量化的花青素在花瓣中的含量较高，而四川栽培品种芍药花的花青素在花瓣中的含量远远低于其他栽培品种。总多酚的含量范围为30.01至82.74 mg(RE)/g。芍药花瓣、花萼和花蕊中的总黄酮含量分别为3.08-8.10 mg(RE)/g、4.11-8.14 mg(RE)/g和0.22-1.37 mg(RE)/g。芍药花不同组织中的总花色苷差异很大，范围从0.10 mg/g DW 到 8.78 mg/g DW。 3.DPPH、FRAP、ABTS、ORAC结果显示，芍药花各部分均有良好的抗氧化能力大小。相关性分析结果显示，芍药花内总多酚含量与抗氧化能力呈正相关关系，而总花色苷含量与抗氧化能力呈负相关关系。MTT结果显示23.44-375 μg/mL的芍药花提取物对RAW264.7无明显毒性。NO实验结果显示，安徽芍药花花蕊组(93.75μg/ml)与模型组相比，均能够显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞外NO的释放。ELISA结果显示，与LPS模型组相比，原产地为安徽的芍药花花蕊提取物的高、中浓度能够显著降低LPS诱导的RAW 264.7细胞IL-6、TNF-α的分泌水平。 结论: 建立了基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)的芍药花快速定性分析的方法，进一步明确了芍药花的物质基础，为芍药花的药效物质研究提供科学依据。基于定量方法，可简便、快速地对不同产地和不同部位芍药花进行化学成分含量差异测定，为芍药花的质量评价提供理论依据。芍药花各部位具有一定的抗氧化活性作用，安徽产地芍药花花蕊能够显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞外NO和炎症因子IL-6、TNF-α的释放。
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