摘要
研究背景与目的： NLRP3炎性小体是一种多蛋白寡聚复合物，其异常激活与多种炎症性疾病的发生密切相关，如溃疡性结肠炎、痛风性关节炎、脓毒血症等。药理性抑制 NLRP3炎性小体是治疗相关炎症性疾病的重要手段之一。中药材来源的天然产物在药物开发的过程中起到极为重要的作用，天然产物作为结构新颖的活性分子重要来源，为新药设计与开发提供了大量的先导化合物。木香烃内酯（COS）在许多炎症性疾病，具有良好的治疗效果和保护作用，如结肠炎、急性肺损伤等。虽然木香烃内酯的抗炎作用比较明确，但是其具体靶点和作用机制还并不明晰。本研究目的旨在探明 COS产生抗炎作用的具体靶点及机制，以及 COS在人类疾病动物模型中的防治效果，以期获得一个具有开发潜力的抗炎药物先导化合物。 研究方法与思路： 本研究首先对 COS的体外作用机制和靶向蛋白进行了探索研究。从实验室自建的天然产物库中筛选出在骨髓来源的巨噬细胞模型中具有优秀IL-1β抑制活性的候选化合物COS，随后在LPS+ ATP刺激的BMDM上探究细胞上清液中IL-1β和caspase-1（p20）释放的影响，以及对细胞裂解液中pro-caspase-1、pro-IL-1β、NLRP3等蛋白质表达的影响，以探究其对 NLPR3炎性小体活化和细胞焦亡的抑制作用。之后，本研究进一步探究COS对不同刺激物（尼日利亚菌素、明矾）引发的NLRP3炎性小体活化及不同炎性小体（AIM2炎性小体、NLRC4炎性小体）的活化的影响，以探究COS抑制NLRP3炎性小体活化的选择性与特异性。之后，通过免疫共沉淀、体外化学交联等实验对炎性小体的组装过程进行探究。随后，通过Pull-down实验探索COS的结合蛋白；通过构建结构域质粒、SPR、BLI等方式探索COS的具体结合区段。之后，通过化合物洗脱与化合物还原突变等实验确定COS的共价结合模式；通过蛋白质质谱、突变质粒Pull-down实验等方法探索COS的共价结合位点；通过对具有共同基团的天然产物进行抗NLRP3活性测试、对单独官能团进行活性测试探索抗NLRP3活性的重要官能团。 同时，本研究对COS在人类疾病动物模型体内通过抑制NLRP3炎性小体活化产生抗炎效果进行了探究。首先，通过局部注射MSU构建痛风性关节炎模型，通过对关节肿胀程度、Hamp;E染色组织切片中炎性细胞的浸润程度、关节浸出液中 IL-1β水平和caspase-1酶活性进行探究，分别对照野生型（WT）组与Nlrp3基因敲除（Nlrp3KO）组、造模组与COS组的疾病表现，探究COS是否通过抑制NLRP3炎性小体活化产生痛风性关节炎的预防作用。随后，通过腹腔注射明矾构建急性腹膜炎模型，通过对腹腔灌洗细胞的组成分析、细胞中IL-1β和p20表达水平进行探究，对照WT组与Nlrp3KO组、造模组与COS组的疾病表现，探究COS是否通过抑制炎性小体活化产生针对急性腹膜炎的预防作用。最后，通过饮用2.5% DSS构建急性溃疡性结肠炎模型，通过对每日体重监测、疾病活跃指数监测、结肠长度、Hamp;E染色组织切片中组织病变统计、结肠组织中IL-1β和p20表达水平进行探究，对照WT组与Nlrp3KO组、造模组与COS组的疾病表现，探究COS是否通过抑制炎性小体活化产生溃疡性结肠炎的治疗作用。 研究结果： 本研究在119种天然产物中，筛选出COS作为具有NLRP3炎性小体优秀抑制活性的天然产物，随后在BMDMs中发现COS对NLRP3炎性小体活化的抑制具有剂量依赖性，同时抑制了细胞焦亡的发生和GSDMD蛋白的剪切。同样的抑制结果也出现在人外周血单核细胞模型及 LPS诱导的小鼠脓毒症模型中。随后本研究发现，COS是一种广泛的具有选择性的NLRP3炎性小体抑制剂，对多种刺激物引发的NLRP3炎性小体激活具有抑制活性，不影响其他种类炎性小体的活化。之后，本研究发现COS对NLRP3炎性小体活化的上游通路不产生影响，包括钾离子外流、氯离子外流和线粒体损伤及线粒体活性氧的产生。之后，本研究发现COS阻断了ASC寡聚体、NLRP3-NEK7和NLRP3-ASC复合体的形成。之后，本研究发现COS直接与NLRP3结合，并以共价方式结合在NACHT结构域。通过蛋白质质谱发现COS共价结合在598位半胱氨酸上，通过计算机模拟计算得出COS与口袋周围的氨基酸产生良好的稳定性。随后对COS及相似天然产物进行构效分析发现，α-亚甲基-γ-丁内酯基团是此类天然产物产生抗 NLRP3活性的重要药效团。最后，本研究发现在痛风性关节炎、急性腹膜炎和溃疡性结肠炎等疾病模型组中，COS通过抑制NLRP3活化产生了体内抗炎活性。 研究结论： 在这项研究中，COS被发现为一种可与NLRP3直接共价结合的选择性抑制剂。COS在体外和体内均具有显著的抗炎性小体活性，这表明它可能被用作开发新型 NLRP3相关疾病治疗药物的先导化合物。根据实验结果， COS以高亲和力直接与 NLRP3的NACHT结构域结合，并与598位半胱氨酸共价链接，从而降低了NLRP3的ATP酶活性，抑制了炎性小体的组装和活化。实验结果表明，天然产物中的α-亚甲基-γ-丁内酯是以共价方式靶向 NLRP3的重要基团，包含该基团结构的天然产物均具有不同强度的抗炎性小体活性。本研究发现，木香烃内酯在 NLRP3相关的炎症性疾病中均具有良好的治疗和保护作用，如痛风性关节炎、急性腹膜炎和溃疡性结肠炎等。因此，木香烃内酯可以作为一种 NLRP3相关疾病的候选药物，同时作为先导化合物可用于设计新型NLRP3抑制剂。
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