摘要
目的： 近年来，基于细胞的耐受诱导治疗在自身免疫性疾病和实体器官移植的发展中取得了极大的突破。其中使用耐受性树突状细胞（tolDC）和调节性巨噬细胞（Mregs）治疗是一种能够有效调控炎症免疫细胞和抑制免疫排斥，并且不损害患者免疫力的保护性治疗方法。这一方法主要依赖tolDC或Mregs诱导生成抗原特异性调节性T细胞（Tregs）。tolDC或Mregs属于专业的抗原提呈细胞（APC），可以将MHCII上的抗原呈递给CD4+T细胞，并引起Tregs产生，从而创建有利的免疫耐受微环境。树突状细胞和巨噬细胞根据抗原的特征以及细胞因子环境共同引起免疫反应，其中，DC发挥着APC的主要任务，负责适应性免疫反应的启动，以及在免疫原性抗原被清除后，控制或消除炎症过程。巨噬细胞发挥着APC的次要作用，负责在免疫反应结束后清除细胞碎片、病原体和其他分子。目前， tolDC的生成及评价体系较为成熟，但对Mregs的生成及不同方法诱导的Mregs之间的比较研究较少。 过去的研究表明，ECDI诱导凋亡的脾细胞能够促进M2型巨噬细胞极化并诱导Tregs生成。但本研究发现，凋亡脾细胞不是生成M2型巨噬细胞，而是诱导生成含有抗原的Mregs，进而引起抗原特异性Tregs，实现免疫耐受。因此，本课题旨在探究ECDI诱导凋亡的脾细胞囊泡与巨噬细胞共孵育后，巨噬细胞表面高表达MHCII以及抗原提呈功能的行为及机制，为凋亡脾细胞囊泡在自身免疫性疾病和实体器官移植中的耐受治疗奠定了基础。 方法： 1.通过流式细胞仪检测巨噬细胞表面蛋白的表达 将凋亡脾细胞与凋亡脾细胞囊泡分别和原代巨噬细胞共孵育，检测巨噬细胞表面F4/80、MHCII、CD206、PD-L1、CD86、MHCI、CD80蛋白的变化。 2.利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）检测巨噬细胞表面基因表达 提取共孵育后巨噬细胞的RNA，逆转录成DNA，检测巨噬细胞中MHCII、CD206、IL-10、TGF-β、PD-L1、Arg-1、TNF-α、iNOS、CD86、IL-12、IL-6基因的变化情况，利用Q-PCR仪进行反应并检测。 3.利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测IFN-γ的分泌量 分别取ECDI诱导脾细胞凋亡不同时间段时的上清液，使用ELISA试剂盒检测IFN-γ的含量。 4.囊泡的制备及其表征的检测 将凋亡脾细胞制备为凋亡囊泡，通过动态光散射仪（DLS）检测凋亡脾细胞囊泡的粒径、电位、稳定性；使用透射电镜（TEM）分析囊泡的形貌特征；使用蛋白质定量法（BCA）检测试剂盒检测凋亡脾细胞囊泡的蛋白量。 5.脾脏中T细胞、B细胞和巨噬细胞的分选 通过T细胞、B细胞和巨噬细胞的磁珠分选试剂盒，对脾细胞进行分选。 6.巨噬细胞抗原提呈能力的检测 巨噬细胞经过凋亡脾细胞囊泡诱导后，与模式抗原DQ-OVA共孵育，检测巨噬细胞的抗原降解能力；使用OVA特异性CD4+T细胞与巨噬细胞共孵育后，检测特异性CD4+T细胞的增殖能力。 7.T细胞增殖实验 使用供体来源的凋亡脾细胞囊泡诱导巨噬细胞，巨噬细胞与受体脾细胞共孵育后，取出受体脾细胞，分别与供体、非供体的脾细胞共孵育。利用流式细胞仪检测供体脾细胞的增殖情况。 结果： 1.通过流式细胞仪检测巨噬细胞表面蛋白的表达 流式结果显示，巨噬细胞分别与ECDI诱导凋亡的脾细胞及凋亡囊泡共培养后，巨噬细胞表面因子MHCII、CD206有所提高，MHCI、CD80和CD86保持不变。 2.利用荧光定量Q-PCR仪检测巨噬细胞表面基因的表达 加入经ECDI诱导凋亡的脾细胞，经Q-PCR检测，计算得出：MHCII、CD206、IL-10、TGF-β、PD-L1和Arg-1的基因表达量上调，iNOS、CD86、IL-12和IL-6的基因表达量基本不变，TNF-α的基因表达量下调。 3.利用ELISA检测IFN-γ的分泌量 经ELISA检测，ECDI诱导脾细胞凋亡1 h，48 h后，上清液中含有少量的IFN-γ。 4.囊泡的制备及其表征的检测 结果显示，凋亡脾细胞囊泡呈现均一的粒径，尺寸为220 ± 30 nm，电位为-10 ± 2 mV，且在4℃环境下可以稳定保存。透射电镜结果可观察到凋亡脾细胞囊泡的形貌。经BCA蛋白检测可知凋亡脾细胞囊泡的蛋白量。 5.脾脏中T细胞、B细胞和巨噬细胞的分选 通过T细胞、B细胞和巨噬细胞的分选试剂盒，得到了纯度较高的三种细胞。 6.巨噬细胞抗原提呈能力的检测 流式结果显示，巨噬细胞经过凋亡脾细胞囊泡诱导后，抗原降解能力增强， OVA特异性CD4+T细胞增殖能力增强，证明巨噬细胞抗原提呈能力增强。 7.T细胞增殖实验 流式结果显示，巨噬细胞经过凋亡脾细胞囊泡诱导后，受体脾细胞与供体脾细胞共孵育时，受体脾细胞中CD4+和CD8+T细胞增殖能力被抑制，Tregs比例显著提高；受体脾细胞与非供体脾细胞共孵育后，受体脾细胞的CD4+和CD8+T细胞增殖能力尽管被抑制，但Tregs比例没有显著性差异。证明供体凋亡脾细胞囊泡可引起免疫耐受。 结论： 本研究将ECDI诱导凋亡的脾细胞与原代巨噬细胞共培养后，通过流式细胞仪和Q-PCR仪检测发现巨噬细胞MHCII的表达量有所增加。但在检测中发现巨噬细胞中仍残留有未凋亡的脾细胞，因此，将ECDI诱导凋亡的脾细胞制备为囊泡。发现凋亡脾细胞囊泡与巨噬细胞共同培养后，MHCII的表达量仍有明显提高。由于脾细胞成分复杂，含有T细胞、B细胞和巨噬细胞等多种细胞，为了探究使MHCII表达增加的具体成分，通过磁珠分选脾细胞，发现凋亡的T细胞和B细胞在MHCII表达中起重要的作用。在后续实验中验证了高表达MHCII的Mregs的抗原提呈能力增强，可以抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖，引起抗原特异性Tregs生成，最终引起免疫耐受。
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