摘要
目的： 河生莱略特氏菌（Lelliottia amnigena）是肠杆菌科的罕见成员之一，在既往对其进行的药敏试验中，描述了该菌对第二代和第三代头孢菌素具有天然耐药性。迄今为止，多个研究都报道了其具有ampC基因，然而，还没有关于河生莱略特氏菌AmpCβ-内酰胺酶的详细研究。在本研究中，我们在测定了一株来自农场的河生莱略特氏菌P13的全基因组序列的基础上鉴定了一个新的由染色体编码的AmpC酶（命名为LAQ-1）。LAQ-1可对多种β-内酰胺类抗生素产生水解作用，包括几种第一代至第四代头孢菌素。除了LAQ-1外，在河生莱略特氏菌P13的质粒（命名为pP13-67）中还发现了一些对四环素、氯霉素、氟苯尼考和链霉素具有抗性的基因。这些发现将有助于阐明这种不同寻常的条件致病菌的耐药机制，并有助于开发河生莱略特氏菌引起的人（或动物）感染的治疗方法。 方法： 1.在2016-2017年期间，从浙江永嘉的一家养殖场采集动物粪便、环境土壤和水样，并在低温保存状态下带到实验室，接种于LB固体培养基，进行了细菌的分离、纯化和保存的操作。 2.通过革兰染色镜检、生物化学反应、质谱鉴定和16S rRNA基因序列测定等方法，对菌株种属进行了初步鉴定。通过全基因组序列的平均核苷酸相似度（ANI）的计算，进一步确定了细菌的种属。 3.从P13基因组中提取DNA，进行全基因组测序，利用生物信息学相关软件对测序结果进行拼接，预测全基因组的开放阅读结构（ORFs），并对其进行功能注释，判断其中是否存在耐药性基因、耐药性基因附近是否有可移动遗传元件，并进一步分析可能的水平转移机制。 4.根据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）规定的操作标准及流程，采用琼脂稀释法检测最低抑菌浓度（MIC），并按照CLSI药敏试验标准（CLSI，2021版）和欧洲肠杆菌科抗菌药物敏感性试验委员会指南（EUCAST，2019版）进行药敏试验的结果确定。 5.基于药物敏感试验结果和全基因组注释结果，选择潜在耐药性基因进行了克隆验证，并利用Softberry在线预测耐药性基因启动子的位置，在SnapGene Viewer软件中设计引物。采用blast软件对克隆成功的插入序列片段的测序结果进行验证，并完成了对其潜在抗性的测定。 6.通过P13染色体介导的新型C型β-内酰胺酶基因经蛋白诱导表达、纯化和酶动力学相关分析的方法，对其进行了详细解析。 7.运用生物信息学软件，对blaLAQ-1基因来源、演化、多态性和周边环境进行了广泛分析。 8.经过多序列比较分析P13多重耐药区域，探讨了耐药性基因多态性及水平转移机制的可能性。 结果： 1.从一动物粪便标本中分离纯化得到河生莱略特氏菌P13。 2.对P13进行生化鉴定，16S rRNA基因序列同源性分析可得菌株P13与河生莱略特氏菌NCTC12124最为接近（两者覆盖度为98%，同源性为99.93%）。全基因组平均核苷酸一致性（ANI）分析，表明河生莱略特氏菌NCTC12124（GenBank：LR134135.1）的基因组与P13基因组之间的ANI值最高，为98.84%。最终确定P13是河生莱略特氏菌。 3.全基因组测序结果提示菌株P13基因组由一个环形染色体和一个质粒（命名为pP13-67）组成。染色体全长4,555,627个碱基，GC含量为52.85%，编码4,240个ORFs。pP13-67全长66,758个碱基，编码79个ORFs，在pP13-67质粒中鉴定出12个与不同MGEs相关的耐药性基因，包括1个喹诺酮类耐药性基因（qnrS1）、2个氨基糖苷类耐药性基因[aph(6)-Id和aadA2]、2个磺胺类耐药性基因（sul1和sul2）、1个β-内酰胺类耐药性基因（blaTEM-1）、1个季铵盐类化合物抗性基因（qacEΔ1）、1个二氨基嘧啶类耐药性基因（dfrA12）、2个四环素耐药性基因（tetA）和2个氯霉素/氟苯尼考耐药性基因（floR）。 4.药物敏感性测定结果显示，P13对氨苄西林、青霉素G、头孢西丁、头孢唑林、四环素和替卡西林/克拉维酸耐药，MIC结果分别为256、1,024、256、8、64、16μg/mL。 5.通过对重组菌株blaLAQ-1/pUCP24/DH5α和pUCP24/DH5α、DH5α的药物敏感性测定结果进行比较分析显示，blaLAQ-1对青霉素G、氨苄西林和几种第一代至第四代头孢菌素，如头孢唑林、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟耐药；与对照菌比较，其对上述药物的MIC值分别上升了4、64、8、4倍。 6．LAQ-1的酶动力学分析结果显示其对哌拉西林的催化效率最高（kcat/Km为107.68）；对第一代和第二代头孢菌素的催化效率较高，如头孢唑林（kcat/Km为39.88）和头孢西丁（kcat/Km为16.92）；但对广谱头孢菌素的催化效率较低（如头孢吡肟，kcat/Km为8.18）。β-内酰胺酶抑制剂半数抑制浓度（IC50）显示，阿维巴坦（IC50:0.001451μM）对LAQ-1有较强的抑制作用，5-鸟苷一磷酸二钠盐（GMP）对其有较弱的抑制作用（IC50:2.626μM）。 7.blaLAQ-1基因全长1,143bp，编码380个氨基酸，LAQ-1蛋白质分子量约39.6kDa。信号肽的切割位点预计位于19（丙氨酸）和20（丙氨酸）氨基酸残基之间。进一步预测LAQ-1的等电点为8.58。尽管在河生莱略特氏菌NCTC12124染色体（NZ_CP023529.1）中发现了一个与blaLAQ-1具有最高核苷酸同源性（99.39%,1,136/1,143）的假定C类β-内酰胺酶（LR134135.1），但与LAQ-1具有最高氨基酸同源性的功能已知的β-内酰胺酶是ACT-6（ACJ05686.1，78.42%，298/380）和CMY-20（AAX58682.2，78.42%，298/380）。 8.在NCBI核苷酸序列数据库中查询了一段以blaLAQ-1基因为中心的长约20kb的片段。检索到五个相似度最高的片段，它们都来自L.amnigena染色体（＞99%的覆盖率和＞95.00%的同源性），在序列结构和基因顺序上都具有保守结构，周围未检测到可移动遗传元件（MGE），在编码fraA-D-blaLAQ-1-sugE的片段两侧有一对完美的8bp反向重复序列（IR）。 9.pP13-67和3个相似度较高的质粒序列进行比较基因组学分析，结果显示这4个质粒主要区别点在于pP13-67的多重耐药区域，且pP13-67的MDR区域存在于其它种属细菌的染色体或质粒中。 结论： 1.本文研究报道了河生莱略特氏菌P13的全基因组序列，发现1个河生莱略特氏菌染色体编码的新型C类β-内酰胺酶基因，命名为blaLAQ-1。 2.blaLAQ-1和河生莱略特氏菌NCTC12124染色体编码的一个功能未知ampC基因的相似度最高为99.39%，由于其氨基酸结构具有典型的C类β-内酰胺酶基序，因此，可以将其作为ampC家族的一个新的分支。 3.LAQ-1可水解青霉素类和头孢菌素类抗生素。阿维巴坦可对其产生强抑制作用，而GMP对其抑制作用较弱。 4.尽管blaLAQ-1周围未检测到MGE，但其相关区域片段的两侧有一对完美的8bp反向重复序列（IR），这表明该基因相关序列有可能在不同种属菌株之间进行水平基因转移（HGT）。 5.质粒pP13-67编码的多重耐药区域与可移动遗传元件相关，多重耐药区域与不同菌种的染色体或质粒的核苷酸序列相似性较高，表明这些耐药性基因在不同种属细菌之间存在水平转移的可能性。
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