摘要
目的：基于网络药理学初步探讨通窍活血汤对血小板聚集的影响及潜在机制。建立体外TCIPA模型，研究乳腺癌4T1细胞与血小板的相互作用；从TCIPA角度探讨通窍活血汤对肿瘤转移的影响，为其临床应用提供实验证据支持。 方法： （1）通过TCMSP数据库及文献补充筛选通窍活血汤中七味中药的主要有效化合物；疾病靶点则通过GeneCards等数据库筛选；利用Venny、String在线平台进行靶点交集和蛋白质互作；富集分析由仙桃学术生信工具提供；基于Cytoscape软件构建“方剂-药物活性成分-靶点基因”及“中药成分-疾病靶点-作用通路”两图；分子对接技术验证通窍活血汤有效活性成分与血小板聚集疾病核心靶点的结合稳定性。 （2）制备通窍活血汤含药血清。CCK-8和划痕实验探究通窍活血汤对4T1细胞增殖、迁移能力的影响。 （3）制备洗涤血小板。建立体外乳腺癌细胞与血小板共孵育的TCIPA模型，微孔法检测不同浓度4T1细胞诱导的血小板聚集率；CCK-8法定量血小板对4T1细胞增殖的影响。微孔、CCK-8和划痕实验分别检测通窍活血汤对TCIPA过程中血小板聚集率、4T1细胞增殖和迁移的影响。 结果： 1.通窍活血汤治疗血小板聚集疾病的重要活性成分为槲皮素、3ss-Hydroxy-5-Androsten-17-One、黄芩素、β-胡萝卜素和睾酮等，核心靶点有PTSG2、AKT1、MAPK3、NOS2和PRKACA等。糖尿病并发症中的AGE-RAGE、流体剪切应力和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白多糖等是药物发挥作用的关键信号通路。分子对接结果显示，药物重要活性成分与疾病核心靶点结合度高。 2.CCK-8实验证实通窍活血汤含药血清对4T1细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性。划痕实验表明10%和20%通窍活血汤含药血清均能够抑制4T1细胞的运动迁移。 3.0.5×105/ml，1×105/ml，5×105/ml，10×105/ml四个浓度的4T1细胞均能够诱导血小板聚集，其中，5×105/ml浓度组作用最强，最大聚集率为15.1±0.9%。ADP组血小板聚集率最大值为15.2±1.2%。与ADP组相比，5×105/ml组的最大聚集率无统计学差异（P＞0.05）。 4.与对照组（4T1单独培养组）相比，48小时和72小时共培养组（4T1+血小板组）的细胞增殖率均增加（P＜0.01，P＜0.05）；48小时时，共培养组细胞的迁移率显著增高（P＜0.01），差异均具有统计学意义。 5.与共培养组相比，5%、10%、20%通窍活血汤含药血清及50、100μg/ml阿司匹林组均能够降低4T1细胞诱导的血小板聚集率，尽管差异不明显。5%、10%、20%通窍活血汤含药血清对共培养组4T1细胞增殖的最大抑制率分别为88.69±13.90%、123.64±39.08%、89.87±12.91%。各浓度通窍活血汤含药血清干预均能降低共培养条件下4T1细胞的迁移率。其中，与共培养组相比，10%含药血清组在24h（P＜0.0001）、48h（P＜0.001）；20%含药血清组在48h（P＜0.0001）的细胞迁移率均明显降低，具有显著统计学差异。 结论： 1.4T1细胞能够诱导血小板聚集（TCIPA）。 2.血小板可促进4T1细胞增殖和迁移。 3.通窍活血汤能够有效抑制4T1细胞增殖和转移。 4.网络药理学和分子对接技术初步预测并验证了通窍活血汤通过槲皮素等有效化合物作用于PTGS2、AKT1和MAPK3等靶点，以多靶点、多通路的方式协同发挥抗血小板聚集作用，且与多条癌症通路相关。 5.通窍活血汤能够抑制TCIPA过程中血小板聚集、肿瘤细胞增殖和迁移能力，其具体机制有待进一步探究。
NETL