摘要
红曲米是以稻米为原料，利用红曲菌在一定条件下发酵而成的一种紫红色米粒。红曲米具有降低高血脂、高血糖和高血压三高疾病的功效，此外，它还有抗炎、抗菌等多种生物学功能。红曲米含有丰富的生物活性物质，如多糖、麦角甾醇、γ-氨基丁酸、不饱和脂肪酸和洛伐他汀等。其中，洛伐他汀是红曲米中的重要活性成分，它能够有效降低血液中的胆固醇和脂蛋白水平，目前关于洛伐他汀在降脂功效方面的研究较为深入，然而近年来的研究发现洛伐他汀具有潜在的抗癌效应，但对于洛伐他汀诱导癌细胞死亡的潜在机制仍不完全清楚。本研究以红曲米中提取的活性成分洛伐他汀作为研究对象，人肝癌细胞HepG2为细胞模型，对洛伐他汀抗癌功效进行评估及对抗癌作用的分子机理进行探究，旨在为提升红曲米中天然他汀的广泛应用提供科学依据。 通过超声辅助法从红曲米中提取洛伐他汀，使用高效液相色谱法测定红曲米洛伐他汀的含量，此方法能够准确的测定出红曲米洛伐他汀的含量，在4-100ug/ml之间具有良好的线性关系。进一步采用硅胶柱层析和树脂吸附法对红曲米洛伐他汀进行纯化，结果表明，经分离纯化后，高效液相测定得到洛伐他汀纯度为96.7％。 红曲米洛伐他汀能够抑制人肝癌细胞HepG2的增殖活性和细胞运动能力。与空白组对比，加入洛伐他汀后能造成人肝癌细胞HepG2细胞形态学出现变化,并具有一定的浓度依赖性。使用流式细胞检测技术对人肝癌细胞HepG2细胞进行检测，发现在洛伐他汀他浓度为12.5μg/ml下，有73.3％的人肝癌细胞HepG2被阻滞于G1期，与空白组66.9％相比提升了6.4％。在采用WesternBlot实验和RT-qRCR实验检测了细胞周期相关蛋白和基因水平的表达，发现洛伐他汀处理细胞后，构成细胞周期G1检查站的p21和p53蛋白与空白组对比表达上调，还上调与周期相关蛋白p16、p18和p27的表达，并且在mRNA水平表达一致;洛伐他汀也抑制CDK2与CDK6的磷酸化水平，从而最终抑制了细胞周期素D1/E1的蛋白表达;这些蛋白和基因的变化最终引发了细胞周期的阻滞。 红曲米洛伐他汀能够促进人肝癌细胞HepG2的凋亡。Hoechst染色实验结果表明，随着洛伐他汀浓度的增加，细胞核浓缩增加，细胞凋亡愈发明显，确定洛伐他汀诱导HepG2细胞的早凋。JC-1染色确定洛伐他汀引发了人肝癌细胞HepG2线粒体膜电位的失衡，流式细胞检测技术定量分析，发现在洛伐他汀浓度为0μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml与25μg/ml的组中人肝癌细胞HepG2的存活率分别为96.9％,94.8％,91.2％,89.1％,确定洛伐他汀诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。WesternBlot实验则通过对凋亡相关的蛋白表达进行了检测，发现洛伐他汀上调了Bax/Bcl-2蛋白的比例，促进了Cytochromec的蛋白表达;刺激了Caspase3、Caspase8和Caspase9的活化，从而促进了细胞的凋亡。 为了进一步研究洛伐他汀影响人肝癌细胞HepG2的基因变化，对洛伐他汀处理的人肝癌细胞HepG2进行了转录组测序，通过对RNA高通量分析全面探讨了洛伐他汀对肝癌细胞的抑制分子机理，测序结果显示通过洛伐他汀处理后人肝癌细胞HepG2中有106个基因发生了显著的变化。进一步对发生变化的这106个基因进行GO分析和KEGG分析，结果显示这些显著变化的基因参与了人肝癌细胞HepG2的生长、增殖以及细胞迁徙等重要的生物学过程和相关的信号通路。最后通过对蛋白质与这些显著变化的基因进行蛋白质网络互作的预测，发现有68个基因参与了网络互作并以VEGFA为中心。这表明了VEGFA是洛伐他汀抑制HepG2细胞生长过程中血管生成的关键性调节因子，靶向VEGFA可能成为一种新的抑制肿瘤生长的方案。
NETL