摘要
研究背景: 心肌梗死是造成心力衰竭的常见原因。成年人的心肌细胞处于终末分化状态,自我更新能力极低（年更新率0.45％-1％）,不足以有效补偿心肌梗死造成的心肌细胞丢失，最终导致心室重塑和心力衰竭。采用再生医学手段，促进内源性心肌细胞增殖以补充丢失的心肌细胞，是治疗心衰的有效途径之一。与成年小鼠心脏不同，新生小鼠心脏损伤后，能够以心肌细胞增殖的方式实现心肌组织完全再生,这为研究心脏再生机制、发掘心肌损伤的治疗靶点提供了理想的模型。近年来，研究发现衰老信号在新生小鼠心脏再生过程中发挥重要作用。衰老蛋白p66Shc不仅能够参与衰老信号的调节，也能通过调节细胞的增殖或凋亡过程，参与多种心血管疾病的发生与发展。但目前对于p66Shc在心肌细胞增殖以及心脏再生中的调控作用知之甚少。本研究旨在通过探讨衰老蛋白p66Shc在新生小鼠心脏再生中的作用，深入探究其调控心肌细胞增殖的分子机制，为了解衰老信号与心脏再生的关系提供新的见解。 研究结果: 一、P66Shc在心脏中的表达情况 1.1P66Shc在小鼠不同发育时期心脏中的表达情况及其细胞定位 获取不同发育时期的小鼠心脏组织，使用qRT-PCR检测p66Shc的表达水平，结果发现p66Shc的表达随年龄的增长逐渐降低，提示p66Shc表达水平的改变可能与出生后小鼠的心肌细胞增殖能力下降有关。免疫荧光染色检测p66Shc的细胞定位，发现p66Shc在心肌细胞中高表达，提示p66Shc可能通过调控心肌细胞的功能参与心脏再生过程。 1.2敲除p66Shc不影响小鼠心脏发育 利用p66Shc敲除（p66ShcKO）小鼠检测p66Shc对心脏发育的影响，结果表明敲除p66Shc不影响小鼠心重体重比、心脏结构及形态，说明敲除p66Shc不影响小鼠心脏发育。检测生理情况下p66ShcKO小鼠的心肌细胞增殖能力，发现增殖的心肌细胞比例降低，提示敲除p66Shc可能导致心肌细胞增殖能力下降，进而影响心脏再生。 二、P66Shc在调控心肌细胞增殖及心脏再生中发挥重要作用 2.1新生小鼠心脏损伤后p66Shc表达变化情况 构建新生小鼠心尖切除模型，利用Westernblotting证实p66Shc在新生小鼠心脏损伤后表达量增加，提示p66Shc可能是新生小鼠心脏再生的重要调节因子。 2.2敲除p66Shc的新生小鼠心尖切除后心脏再生潜能丢失 为探究p66Shc在心脏再生中的作用，我们对1天龄（P1）的野生型（WT）及p66ShcKO小鼠实施心尖切除手术。结果显示，敲除p66Shc导致P1小鼠心尖切除后心脏不能完全再生;与对照组相比，术后21天心功能明显降低，且心肌细胞增殖能力、去分化程度明显下降。 2.3敲除p66Shc的新生小鼠心梗后心脏再生潜能丢失 为进一步确认p66Shc在心脏再生中的作用，我们对P1小鼠构建了心肌梗死模型。结果显示，敲除p66Shc导致P1小鼠心梗后心脏不能实现再生;与对照组相比,术后28天心功能明显降低，且心肌细胞增殖能力明显低于对照组。 2.4敲除p66Shc对心脏再生过程中非心肌细胞的功能无明显影响 对1天龄新生小鼠构建心肌梗死模型，通过流式细胞仪检测免疫细胞变化。结果显示，心梗损伤后，敲除p66Shc未导致巨噬细胞数量发生明显改变。对内皮细胞标志物CD31进行免疫荧光染色，利用ImageJ软件统计血管密度，检测心梗损伤后血管新生能力，结果显示敲除p66Shc不影响心脏损伤后的血管新生过程。为了探究p66Shc是否通过调控成纤维细胞的衰老参与心脏再生过程，我们对P1小鼠实施心尖切除手术，分别于手术后4天、7天检测衰老相关基因的表达水平，结果显示敲除p66Shc未降低衰老相关基因的表达。敲除p66Shc未对巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等非心肌细胞产生显著影响，提示p66Shc不通过如上非心肌细胞参与心肌再生调控。 三、P66Shc调控心肌细胞增殖的分子机制 3.1敲低p66Shc抑制心肌细胞增殖 为进一步探究p66Shc对心肌细胞增殖的调控作用，我们从野生型一天龄新生小鼠分离原代心肌细胞，利用特异性小干扰RNA（siRNA）敲低p66Shc的表达，利用qRT-PCR及Westernblotting检测p66Shc的敲低效率，确认心肌细胞中p66Shc的表达被明显敲低。通过检测EdU、pH3、Ki67等阳性心肌细胞的比例，发现敲低p66Shc明显抑制心肌细胞增殖，并且未导致明显的心肌细胞凋亡。 3.2敲低p66Shc调控心肌细胞代谢模式转换 心肌细胞代谢模式的转变与心肌细胞的增殖能力密切相关，糖酵解代谢对于心肌细胞的增殖是有利的，因此我们也检测了p66Shc对心肌细胞代谢的影响。对原代心肌细胞敲低p66Shc后，利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测心肌细胞能量代谢变化。结果表明，敲低心肌细胞p66Shc的表达后引起心肌细胞糖酵解水平降低,氧化磷酸化水平升高，进一步证明了p66Shc是心肌细胞增殖所必需的。 3.3P66Shc通过β-catenin/cyclinD1信号轴调控心肌细胞增殖 为了探究p66Shc调控心肌细胞增殖的分子机制，我们对敲低p66Shc的心肌细胞进行RNA测序。RNA测序结果显示有1449个差异表达的基因，其中620个基因上调，829个基因下调，表明p66Shc广泛调控心肌细胞中基因的表达。对差异基因进行GO分析，发现多条与细胞分裂增殖有关的信号通路发生改变，包括:经典Wnt/β-catenin信号通路、Erk信号通路。 为了进一步明确心肌细胞中p66Shc调控的具体信号通路，我们利用Westernblotting检测相关信号通路主要效应蛋白的表达水平。结果发现，仅经典Wnt信号通路下游效应蛋白β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平明显下调;且β-catenin的675位点丝氨酸的磷酸化水平显著降低，该位点的磷酸化介导β-catenin入核，调控下游基因的表达。 敲低心肌细胞中β-catenin的表达明显抑制心肌细胞的增殖，该结果与敲低p66Shc导致心肌细胞增殖能力降低一致。而在敲低p66Shc的同时过表达激活形式的β-catenin,能够挽救敲低p66Shc导致的心肌细胞增殖能力下降。该结果证明p66Shc主要通过经典Wnt/β-catenin信号通路的效应蛋白β-catenin调控心肌细胞增殖。 进一步探究p66Shc/β-catenin调控的下游信号发现，敲低p66Shc导致cyclinDI的表达水平显著下降，过表达激活形式的β-catenin能够挽救敲低p66Shc导致的cyclinD1表达水平下降。以上结果说明p66Shc通过β-catenin/cyclinD1信号轴调控心肌细胞增殖。 四、P66Shc在成年小鼠心脏损伤后修复中的作用 对8-10周龄的成年小鼠构建心梗损伤模型，探讨p66Shc是否参与成年小鼠心脏损伤后的修复过程。结果显示，成年小鼠心梗损伤后，与WT小鼠相比，敲除p66Shc导致小鼠心脏功能明显下降，说明敲除p66Shc会导致成年小鼠心脏功能恢复能力下降。以上结果提示，p66Shc在成年小鼠心梗后的心肌组织修复中同样发挥了重要作用。 结论: 通过以上实验可以得出如下结论:P66Shc是新生小鼠心脏再生所必需的衰老信号蛋白，敲除p66Shc导致新生小鼠心脏损伤后不能再生，心肌细胞增殖能力下降。P66Shc主要通过β-catenin/cyclinD1信号轴调控心肌细胞增殖。P66Shc在成年小鼠心梗后的心肌组织修复中也发挥了重要作用。本研究揭示了衰老蛋白p66Shc在心脏再生中的关键作用，为研究衰老信号与心脏再生的关系及其分子机制提供了新的依据。
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