摘要
随着化石燃料的大量开采与使用，其弊端也日益显现，能源转型迫在眉睫，生物能源作为清洁高效的新型能源被寄予厚望。产溶剂梭菌是一类极具潜力的工业微生物，它可以利用多种碳源，包括各种单糖、二糖和多糖，并且在此过程中产生丙酮和丁醇等有用的化合物[3]，丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum就是一种重要的产溶剂梭菌。但是，到目前为止，针对这类梭菌的基因编辑工具相对匮乏，严重限制了对其的开发利用。因此，本论文以C.acetobutylicumATCC824（以下简称ATCC824）为研究对象，开发一套新的高效的基因编辑系统，包括Red/ET重组系统和基于CRISPR/Cas技术的反向筛选系统，以提高梭菌的重组效率，从而实现梭菌的高效编辑。此外，为进一步优化C.acetobutylicum发酵性能，构建高性能的工业菌株，本论文还探究了热激蛋白相关基因对C.acetobutylicum耐受性能的影响。 首先，本论文筛选了两种不同来源的候选重组酶，分别是来自于C.kluyveri的Redα和Redβ蛋白以及来自于C.perfringens的RecT蛋白。以梭菌基因组中C_AC1502为靶标基因，考察Redα/β蛋白的重组能力，实验结果表明，Redα/β可以在ATCC824内正常表达，并且在同源臂长度为1500bp的条件下，能够介导ATCC824中的双链DNA重组；此外，本论文设计了一个恢复抗性基因突变的实验考察RecT蛋白的重组能力，实验表明，RecT在短同源臂的条件下（80bp）就能够在ATCC824体内介导外源质粒的DNA重组，但重组效率较低，仅为30CFU/μgplasmid，在此基础上进行一系列优化实验，将RecT介导的重组效率提高至45CFU/μgplasmid。 其次，本论文成功构建了基于CRISPR/Cas技术的反向筛选系统，该系统利用Cas9蛋白对梭菌具有毒性的特点进行反向筛选，采用乳糖诱导型启动子bgaLR控制Cas9蛋白的表达，实验证明，在未使用乳糖诱导的情况下，Cas9蛋白并不会出现泄漏表达，不会影响ATCC824的正常生长；而经乳糖诱导表达后，Cas9蛋白可对菌株进行有效杀伤，致死率高达100%。本实验为后续实现梭菌体内多基因无痕筛选奠定基础。 最后，本论文探究热激蛋白负调控因子HrcA对ATCC824发酵性能以及耐受性能的影响。ABE发酵结果表明，通过CRISPR/dCas技术失活hrcA基因后，改造菌株的葡萄糖消耗量从67g/L提高到74g/L，丙酮、乙醇和丁醇的产量分别从5.51g/L、1.05g/L、11.19g/L提高至6.29g/L、1.19g/L、12.66g/L，总溶剂产量提高了16.48%。酸碱耐受试验结果表明，酸性环境对hrcAKD菌体生长的抑制程度低于ATCC824，即hrcAKD具有更高的抗酸性胁迫的能力。丁醇耐受实验结果表明，外源丁醇浓度在8-20g/L范围时，丁醇对hrcAKD的生长抑制程度较ATCC824略低。为进一步明确在胁迫环境下HrcA对梭菌整体的调控过程及响应基因，本论文对出发菌株ATCC824和改造菌株hrcAKD进行全局转录组学分析，通过GO功能分类和KEGGPathway分析表明，差异表达基因在细胞膜组分以及碳代谢通路中分布较多，说明抑制hrcA的表达可能对细胞膜构成以及代谢通路造成影响。 本论文筛选不同来源Red重组蛋白、考察其重组能力并进行初步优化，以及成功证明了Cas9蛋白可以有效杀死梭菌细胞，可作为新型反向筛选工具，这些工作可为后续Red重组工程在梭菌中的开发应用提供有价值的参考。此外，本论文还深入研究了热激蛋白相关基因hrcA对C.acetobutylicum丁醇耐受性的影响，为解析丁醇耐受性基因、构建高丁醇耐受性菌株奠定基础。
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