摘要
逆境是植物生长的主要限制因子。矮牵牛（Petuniahybrida）是重要的园林观赏植物，但其不耐寒的生物学习性极大地制约了它在园林中的应用。课题组前期对保存的矮牵牛自交系进行了抗寒性评价，从中筛选出较抗寒的株系，代号H，并利用低温胁迫下H的表达谱芯片初步筛选出冷响应途径中的候选基因。本研究在此基础上，测定了低温胁迫对矮牵牛H花青素，游离脯氨酸及可溶性糖含量的影响。并且，对4个候选基因（分别编码2个ERF类转录因子，1个RING-H2锌指蛋白基因以及1个CCR4相关因子1蛋白基因，依次命名为PhERF1x，PhERF2x，PhZFP2和PhCAF1a）的组织及诱导表达谱进行了分析。此外，对5个锌指蛋白候选基因进行了功能鉴定。具体研究结果如下： 1.调查低温胁迫对矮牵牛叶片中花青素、游离脯氨酸和可溶性糖含量的影响。结果表明,花青素相对含量在低温处理2h和24h时较对照无显著性差异,当胁迫增至120h，出现显著提高；游离脯氨酸含量在低温处理2h时较对照无明显变化,而在24h达到峰值；可溶性糖在低温处理2h时含量较对照有明显提高，直至120h一直保持在这一较高水平。 2.基因PhERF1x，PhERF2x，PhZFP2和PhCAF1a的组织及诱导表达谱分析：利用半定量RT-PCR分别检测其在根、茎、叶和花中的表达特性，结果表明，4个基因在这4个组织器官中都有表达，但表达强弱略有不同。利用实时定量PCR检测了这4个基因在低温、干旱、高盐、高渗、ABA和MeJA胁迫处理下的诱导表达情况。结果显示，这4个基因的表达量在各胁迫条件下都表现出不同程度的上调。 3．5个锌指蛋白基因的克隆与遗传转化：分析获得的5个锌指蛋白基因CDS序列，其中PhZFP1、PhBBX8和PhTZF1都是新基因，将CDS序列上传到NCBI中序列号分别为：KM603510、KM189192、KM507320；另外2个基因分别是PETZFP4（序列号：D26086.1）和PETZFDB1（序列号：D26083.1）。针对这5个目的基因，分别构建植物超量表达载体，及RNAi载体，并在矮牵牛W115中进行遗传转化。目前获得的T0代阳性植株：PhZFP1，PETZFP4，PETZFDB1，PhBBX8和PhTZF1基因超量表达植株分别有64，23，1，3和1株；PhZFP1，PETZFP4和PhBBX8基因干涉植株分别有11，4和8株。 4.5个锌指蛋白基因的组织表达谱分析：利用实时定量PCR对5个锌指蛋白基因在根、茎、叶芽、成熟叶、老叶及花中的表达进行了检测。结果表明，5个锌指蛋白在这6个组织部位中都有表达，但表达强弱略有差异。 5.亚细胞定位与转录激活活性的分析及验证：利用水稻原生质体来研究各个基因的亚细胞定位，结果显示，这5个基因定位于细胞核中；利用酵母体系对各个基因的转录激活活性进行验证，结果表明，PhZFP1，PETZFP4，PETZFDB1和PhBBX8基因都具有转录激活活性。 6.对超量表达PhCBF3的转基因株系中5个锌指蛋白基因的表达量进行检测：结果表明，在转基因植株中PhZFP1，PETZFP4和PhBBX8基因的表达量明显高于对照，而PETZFDB1和PhTZF1基因的表达量与对照差别不大。
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