摘要
线虫是一类可以寄生于动植物或生活于土壤中的生物，对农作物、禾本科植物、观赏花卉等造成严重危害。利用微生物的生物防治是一种非常有前景的抑制有害线虫的方式。其中，淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）等和苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensi）各有优缺点。淡紫拟青霉是属半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、丛梗孢科（Monilaceae）、拟青霉属（Paecilomyces）一类可寄生于植物线虫的病原真菌。淡紫拟青霉分泌的几丁质酶与丝氨酸酶通过破坏卵壳的结构，使线虫卵无法孵化，也可作用于线虫的二龄幼虫。由于淡紫拟青霉具有很好的生物防治活性，使得其在生物农药中有很大应用价值。但是淡紫拟青霉生长周期长、对线虫起效慢，而苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白Cry5B同样对线虫具有很好的防治效果，但由于苏云金芽胞杆菌在植物根际定植能力差，使得其在实际应用中有一定的局限性。本课题将苏云金芽胞杆菌的cry5B基因转入淡紫拟青霉菌株中，同时解决了淡紫拟青霉对线虫起效慢与苏云金芽胞杆菌定植能力差的问题，获得了对线虫防治效果更好的淡紫拟青霉菌株。 在实验室已构建的质粒pcPCT的基础上，采用重叠延伸的方法将淡紫拟青霉中几丁质酶（chitinaseprecursor）前体信号肽基因chi与丝氨酸酶前体（serineproteaseprecursor）信号肽基因ser连接到cry5B基因的5’端，得到中间载体pcPCCT与pcPSCT。再将连有信号肽基因chi与ser的cry5B基因及其表达元件一起连接到质粒pUPCTPNT，构建可以在农杆菌与淡紫拟青霉中穿梭的穿梭载体pUPCCTPNT与pUPSCTPNT，通过冻融法将质粒pUPCTPNT、pUPCCTPNT、pUPSCTPNT转化到根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105中，得到分别含有这三个质粒的农杆菌EHpUPCTPNT、EHpUPCCTPNT、EHpUPSCTPNT。最后，采用根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系（Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT）将农杆菌EHpUPCTPNT和EHpUPCCTPNT与野生型淡紫拟青霉的孢子悬液共培养，分别获得仅含有cry5B基因与含有信号肽基因chi与cry5B的淡紫拟青霉转化子ACSS-N和ACSS-C。 通过PCR扩增基因sig-cry5B、chi-cry5B、TtrpC-PgpdA、nptII，初步验证ACSS-C、ACSS-N均为阳性转化子。以地高辛标记的cry5B基因为探针进行SouthernBlot实验，进一步证明目的基因插入到ACSS-C中的位点有两个，插入到ACSS-N中的位点有一个。RT-PCR结果表明基因chi-cry5B、cry5B、nptII均在ACSS-C中转录，cry5B、nptII在ACSS-N中转录。实验表明ACSS-C、ACSS-N、ACSS孢子的萌发率分别为76.9%、71.4%、84.3%；在本实验条件下测得ACSS-C、ACSS-N、ACSS的生物量分别为12.06g、10.33g、13.74g。在不同培养基中培养3株菌发现在PDB培养基中3株菌的生长状态没有显著差别，但是在M9中，ACSS-C的长势明显较差，而LB中ACSS呈现悬浮的状态，不会沉在瓶底。这可能是因为外源基因随机插入到淡紫拟青霉代谢相关的重要酶中，导致淡紫拟青霉的生长状况发生变化。进一步的生物测定实验表明ACSS-C、ACSS-N、ACSS对根结线虫的致死率分别是73.1%、41.9%、38.6%，ACSS-C对线虫的致死率是ACSS的两倍，推测可能是信号肽基因chi发挥作用，介导Cry5B蛋白分泌到胞外，提高了淡紫拟青霉的生防活性。 本研究首次成功在苏云金芽胞杆菌中的cry5B基因的5’端连接ACSS几丁质酶前体信号肽基因chi，并将其一起转化到丝状真菌淡紫拟青霉中，构建了既具有一定的植物根际定植能力，又具有对线虫更强的生防活性的淡紫拟青霉转化子，为高效生物农药在农业生产中的应用提供可能。
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