金黄霉素类化合物是一组由苯并萘并吡喃酮为母核结构并与一个七碳糖结构通过碳糖苷键连接而成的糖苷类抗生素，通常由链霉菌发酵产生，显示出广泛的生物活性，包括抗噬菌体、抗菌、抗神经炎和细胞毒性。特别是金黄霉素A不仅对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌显示出强大的抑制作用，而且还具有优秀的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的药物先导化合物。然而，原始菌株来源的金黄霉素生产效价低，副产物多，严重限制了其工业化生产。此外，自然筛选、诱变、菌种杂交等传统的菌种改良方法具有劳动强度大、耗时长等缺点。因此，利用基因工程手段提高金黄霉素产量具有重要的研究和应用价值。本论文从一株海洋来源的产金黄霉素链霉菌出发，结合生物信息学分析和Red/ET同源重组技术对金黄霉素生物合成基因簇进行克隆，并通过结合转移系统实现金黄霉素生物合成基因簇的异源表达和倍增，具体研究内容和结果如下： 本论文首先通过第二代和第三代测序技术，以一株来源于中国南海红树林的产金黄霉素链霉菌891（Streptomycessp.891）为对象，组装了高质量的染色体水平基因组和质粒。对该菌株的antiSMASH分析揭示了一个关键的Ⅱ型PKS生物合成基因簇（chry891），与StreptomycesalbaduncusAD819中的金黄霉素生物合成基因簇（chry）显示出74%的高度同源性，区别在于减少了至少7个参与调节或抗性的基因，并增加了3个调节或辅因子的候选基因，这可能进一步促进了金黄霉素的生物合成。此外，还推测了链霉菌891产金黄霉素的生物合成途径。接下来，以p15A质粒为载体，链霉菌891基因组为模板，通过Red/ET同源重组技术，一步克隆构建了含有完整金黄霉素生物合成基因簇的质粒p15A-chry。 利用大肠杆菌-链霉菌接合转移系统，金黄霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M145、白色链霉菌J1074、变铅青链霉菌TK24中成功异源表达，首次实现金黄霉素在异源宿主中的生产。通过对比三株异源重组菌株在不同培养基下金黄霉素的表达情况，发现天蓝色链霉菌M145-chry在891发酵培养基中金黄霉素的产量最高，总效价为14.476±0.613mg/L，其中金黄霉素A、B、C的含量分别为10.877±0.110、1.331±0.017、2.269±0.486mg/L。此外，与异源宿主天蓝色链霉菌M145相比，插入大片段DNA以及金黄霉素的产生并不会对重组菌株M145-chry的生长情况造成明显影响，并且其具有良好的遗传稳定性，经过五次传代培养，产金黄霉素的水平与第一代相当。 通过大肠杆菌-链霉菌接合转移系统，在产金黄霉素链霉菌891中插入一个额外的金黄霉素生物合成基因簇，获得倍增菌株891-chry，其金黄霉素摇瓶发酵总效价为1066±62mg/L，与原始菌株891相比提高约16%。此外，菌株891-chry具有良好的遗传稳定性，经过五次传代培养，产金黄霉素的水平与第一代相当。 本研究首次实现金黄霉素生物合成基因簇的异源表达，获得一株遗传上易操作、生长状况良好、且稳定性高的金黄霉素生产菌株，为剖析金黄霉素的生物合成途径和产生具有改良活性的金黄霉素衍生物提供了坚实的基础。此外，还成功增加了金黄霉素生物合成基因簇在原始生产菌株中的拷贝数，提高了金黄霉素的生产效价，为开发高效稳定的工业生产菌株提供了有效的技术手段。
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