摘要
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪肠道疾病，主要侵袭小肠上皮细胞，具有致仔猪严重急性水样腹泻、高发病率和高死亡率等特点，给全球猪肉行业造成巨大经济损失。 PEDV属于RNA病毒，具有高突变性，所以现有疫苗对于变异毒株的保护能力有限，并且肌注主要刺激机体产生IgG，产生sIgA的水平较低，所以研究一款能够刺激机体产生黏膜反应，提高sIgA水平的疫苗是非常必要的。因此本试验根据毒力蛋白(S)的中和抗体区域(COE)和S1亚基与S2亚基的N端结合区域设计抗原蛋白片段(aa301-644)与载体pNZ8148连接，构建表达PEDVS蛋白的乳酸乳球菌亚单位疫苗，通过添加粘膜免疫佐剂CPG-ODN，研究对小鼠免疫原性和肠道菌群的影响。 根据NCBI登录(NO.AJ1102)的PEDV基因序列，通过蛋白二级结构预测，选取基因片段（301aa-644aa）进行密码子优化，添加酶切位点和保护碱基后，让生工生物公司进行连接转化。将合成的S基因片段和表达载体pNZ8148相连接并电转进入NZ9000乳酸乳球菌中。重组乳酸乳球菌经乳酸链球菌素(nisin)诱导表达后，采用SDS-PAGE和Westernblot和细菌间接免疫荧光鉴定诱导表达产物。因口服重组乳酸乳球菌需要经过胃酸的消化到达小肠定植，所以对重组乳酸乳球菌生长曲线进行测定，并置于模拟胃液和肠液中，于不同时间抽取菌液测定其OD值，检测重组菌对胃液和肠液的耐受性。 将试验组分为口服组（包括PBS组空白对照组、佐剂CPG-ODN组、重组菌组、重组菌＋CPG-ODN组）和滴鼻组（包括重组菌和重组菌＋CPG-ODN组）接种小鼠，连续接种3次，每次免疫间隔14d，每次连续接种3d；ELISA检测血清中INF-γ水平、IL-4水平和抗PEDVS蛋白特异性IgG水平，肠道中抗PEDVS蛋白特异性sIgA水平。然后分别取口服组小鼠的盲肠内容物液氮速冻后存放于-80℃冰箱中备用，干冰保存送于公司进行16SrRNA测序，鉴定重组乳酸乳球菌载体疫苗对于小鼠肠道菌群的影响。 SDS-PAGE和Westernblot结果显示，PEDVS蛋白在重组乳酸乳球菌中表达，并且经条件优化后，得到最佳诱导条件为5ng/mL浓度nisin诱导2h的蛋白表达量最高。测定乳酸乳球菌NZ9000和重组乳酸乳球菌pNZ8148-S/NZ9000的生长曲线，耐胃液和耐肠液的特性，发现转化PEDVS蛋白后不会影响乳酸乳球菌NZ9000的生长，在胃液和肠液可以存活约2-3h。 与PBS空白组和单独佐剂CPG-OND佐剂相比，接种重组乳酸乳球菌和重组乳酸乳球菌＋CPG-ODN组小鼠的抗PEDVS蛋白特异性IgG和sIgA水平有明显升高(p＜0.05)，INF-γ和IL-4水平也有明显升高(p＜0.01)，并且在二免后sIgA达到最高水平，三免后抗体水平开始有下降的趋势(p＜0.05)，表明重组乳酸乳球菌经口服和滴鼻接种后能够诱导机体产生黏膜和体液免疫反应。肠道菌群结果说明免疫后重组乳酸球菌疫苗、单独CPG佐剂和重组疫苗与佐剂联合免疫都可以增加小鼠肠道菌群的丰度。chao指数和Simpon指数说明口服重组乳酸乳球菌疫苗可以增加肠道菌落的多样性。免疫后对照PBS组，免疫组小鼠的肠道菌群物种发生了改变，免疫组从主要的乳杆菌属变成毛螺菌属，其中佐剂CPG主要还影响Desulfovibrio属和norank_f_f082属的丰度，但是REB和CPGODN联合使用能够降低CPG对于Desulfovibrio属丰度的影响。
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