摘要
核酸适配体因其化学和热力学稳定性好、易于合成和成本低等突出优点，已被广泛应用于生物分析领域。目前，科研人员设计和构建了多种基于适配体的传感方法，如比色法、荧光法等方法，并用于检测各种类型的疾病生物标志物。本论文针对心血管疾病生物标志物心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），构建基于核酸适配体的新型检测方法与传感器件，以突破传统免疫分析方法的限制，实现生物标志物的稳定和灵敏检测。具体研究内容如下： 1、构建了cTnⅠ的酶联杂化三明治测定方法（ELHSA）。该方法区别于传统的“抗体-抗原”免疫分析方法，具有独特的“抗体-目标-信号适配体”三明治结构。通过研究获得了抗体-适配体的最佳组合和链霉亲和素-辣根过氧化物酶共价连接物（S-HRP）与生物素修饰的适配体的用量比。并揭示了cTnⅠ与两种识别元件之间的一种最为有利的相互作用模式，即先与适配体结合的cTnⅠ蛋白可以被抗体很好地识别。牛血清白蛋白（BSA）除了作为封闭剂外，还可以在信号探针溶液中作为增强剂提高ELHSA的灵敏度和重现性。该BSA辅助的ELHSA可检测到低至0.24ng/mL的cTnⅠ。 2、设计并对比了基于ELHSA的比色和荧光适配体传感方法用于cTnⅠ的检测。首先基于上述比色ELHSA，获得了最佳的抗体种类和抗体浓度，揭示了抗体的识别位点对cTnⅠ的识别效率的重要影响。固定适配体（Apt2）的前提下，抗体在cTnⅠ上的最佳识别位点为41aa~50aa。经优化后的比色分析方法对cTnⅠ的检测限为48pg/mL，较之前提高了一个数量级。此外，将S-HRP替换为链霉亲和素-碱性磷酸酶（S-ALP），获得了ELHSA荧光适配体传感方法。经对该新共价连接物与生物素修饰的适配体的用量比的优化后，该荧光方法的检测限达到3.47ng/mL。 3、基于上述抗体-适配体杂化识别策略，设计了一种用于检测cTnⅠ的侧向流动分析试纸条。将上述工作中的链霉亲和素-酶共价连接物替换为链霉亲和素修饰的金纳米颗粒（AuNPs），优化了检测线上抗体种类、抗体浓度，以及信号探针溶液中适配体的浓度。研究表明适配体浓度对目标物cTnⅠ的识别有重要影响，适配体浓度过低，AuNPs易发生聚集；适配体浓度过高，AuNPs上高密度的适配体产生的空间位阻会削弱其对cTnⅠ的识别能力，同时也会影响适配体与质控线上其互补序列的杂交。该侧向流动分析试纸条对cTnⅠ的检测限为6.54ng/mL，且同样表现出有良好的选择性。
NETL