摘要
背景：自2020年开始，乳腺癌（BreastCancer,BC）已成为全球发病率最高的恶性肿瘤。大多数BC患者死亡的原因不是由于原发性肿瘤本身，而是因为肿瘤转移到体内其他器官所致。据统计，出现远处非淋巴结转移的BC患者5年生存率约为23%，远低于无转移患者的生存率。因此，寻找BC细胞侵袭转移过程中的关键调控因子，可能成为精准抗转移治疗的一个新希望。本课题组多年来一直致力于研究Pokemon基因在BC中的相关作用及机制，之前的研究结果表明Pokemon通过抑制Smad4表达和上调Survivin表达来促进BC的进展。近期有研究发现Pokemon基因可以反向剪接形成一个环状RNA产物（hsa_circ_0000875，本文统一称为circPOKE）。circPOKE通过共激活间质肿瘤中的ILF2/3复合物调控增殖和促血管因子生成，是一种致癌性环状RNA。然而，circPOKE是否在BC中发挥相关作用目前尚不清楚。因此，本研究首先拟确定circPOKE是否在BC正常组织与肿瘤组织中的表达水平存在差异，进而阐明其在BC发生发展中的功能及作用机制。 目的：探讨circPOKE在体内、体外对BC侵袭转移的抑制作用及作用靶点和相关机制，并为BC的治疗提供新思路及潜在的治疗途径。 方法：首先，利用RT-qPCR检测circPOKE在BC组织及癌旁组织之间的表达差异，以明确circPOKE的生理性质。随后，构建稳定过表达circPOKE或使用siRNA敲低circPOKE的BC细胞系，通过体外功能获得或功能丧失实验检测circPOKE在BC细胞中的作用，利用WesternBlot实验验证circPOKE对BC细胞中上皮-间充质转变（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）标记蛋白的调控作用，以及体内动物实验确定circPOKE对BC细胞体内转移能力的影响。进一步，采用RNApull-down联合质谱分析，鉴定出与circPOKE相互作用的候选蛋白，再通过RNApull-down、RNA免疫共沉淀、激光共聚焦显微镜进一步验证相互作用，以明确circPOKE抑制BC转移的分子机制。此外，借助功能回复实验，观察下游基因的再表达能否部分恢复circPOKE过表达对BC细胞表型和功能的抑制作用。接下来，运用Transwell共培养系统，探究circPOKE是否能被外泌体负载分泌至细胞外，参与细胞间通讯，以实现表型复制，并用负载circPOKE的外泌体(exo-circPOKE)对荷瘤小鼠进行治疗，通过活体成像探讨exo-circPOKE对BC细胞转移能力的影响。最后，采用免疫组化和原位杂交技术检测、分析BC临床样品中circPOKE及其相互作用蛋白的临床相关性。 结果：与癌旁组织相比，circPOKE在BC组织中低表达，与原发性BC组织相比，circPOKE在转移性BC组织中表达更低。过表达circPOKE抑制BC细胞的转移潜能，但不影响BC细胞的增殖表型。反之，敲低circPOKE则减弱了这种抑制作用。WesternBlot结果显示，过表达circPOKE对EMT关键转录调控因子—Snail的抑制效果最明显。机制上，circPOKE通过竞争性结合去泛素化酶USP10，减弱USP10与Snail的结合，从而通过蛋白-泛素降解途径抑制Snail的稳定性。此外，circPOKE可以通过外泌体分泌至细胞外介导细胞间通讯，负载circPOKE的外泌体能抑制BC细胞的侵袭迁移能力，并显著减弱荷瘤小鼠的肺转移。临床上，circPOKE在BC癌组织中低表达，USP10和Snail在BC组织中高表达，且circPOKE的表达水平与USP10、Snail的表达呈负相关，提示circPOKE可能作为BC转移患者潜在的治疗靶点。 结论：研究揭示了circPOKE在抑制BC转移中的重要作用。1.circPOKE在BC中低表达，过表达circPOKE抑制BC细胞的侵袭、迁移，但不影响BC细胞的增殖表型。2.circPOKE通过竞争性结合USP10,促进Snail的泛素化降解，抑制BC转移。3.外泌体能负载circPOKE分泌至细胞外，抑制荷瘤小鼠的肺转移。
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