摘要
研究背景 早年不良应激，如母婴分离(MS)、虐待、父母离异等，可影响个体情感行为和学习记忆能力。哺乳动物在出生阶段母亲为其提供营养、温度及感知觉刺激，而长时程的MS中断了幼崽与母亲之间的联系，导致幼崽成年后罹患焦虑抑郁等精神疾病的风险增加，这符合人类父母长期外出导致的亲子关系的破坏。目前MS诱导个体的行为异常及其发病机制尚未完全清楚，HPA轴功能紊乱、表观遗传学改变及神经营养是当前研究聚焦的方向。研究表明海马齿状回(DG)神经发生和突触可塑性的异常与情志疾病密切相关，早年阶段的应激极有可能导致神经结构和功能异常而造成精神障碍，但MS如何影响个体成年后的行为表现，以及通过何种机制影响神经发生和突触可塑性仍无定论。课题组前期研究显示，温阳解郁方(二仙汤及逍遥散组合)对MS小鼠的行为表现、HPA轴亢进、神经可塑性降低等具有良好的调节作用，初步表明从肝郁肾虚病机入手进行MS所致精神障碍的诊治具有可行性。因此本研究以MS为造模方法，研究MS仔鼠成年后行为表现、神经发生和突触可塑性的变化情况，探索其变化的机制，从神经营养的角度出发，揭示脑源性神经营养因子介导的胞内信号通路对神经发生和突触可塑性的调控机制。其次研究温阳解郁方对此机制的调节作用，为MS所致情志障碍的生物过程、分子机制和治疗提供新的见解。 目的 观察MS模型小鼠行为、海马神经发生和突触可塑性的变化情况及温阳解郁方的调节作用。采用雷帕霉素抑制海马mTORC1信号，研究温阳解郁方对MS小鼠海马BDNF/TrkB介导的mTOR信号通路、神经发生和突触可塑性及宏观行为的影响，研究温阳解郁方治疗MS小鼠行为异常的作用机制 方法 幼崽出生当天为第0天(PD0),在PD5～PD14进行MS,每天8h(9:00-17:00);PD21离乳后将MS仔鼠随机分为模型组，温阳解郁方低、中、高剂量组(8.35g·kg-1、16.70g·kg-1和33.40g·kg-1)、氟西汀组(2.6mg·kg-1)和温阳解郁方中剂量+雷帕霉素组(100mg/kg),各给药组饲喂药混饲料至成年PD90。 开放矿场、高架O迷宫、Morris水迷宫和新颖物体识别等实验检测小鼠的焦虑抑郁状态和学习记忆能力;ELISA法检测小鼠血浆中CORT、ACTH的含量;HPLC-ECD法检测海马DA、5-HT、NE、DOPAC、5-HIAA、HVA含量;BrdU标记、免疫组织化学、免疫荧光化学等检测小鼠海马DG区神经发生和突触可塑性的变化;Westernblot法、qRT-PCR法检测BDNF/TrkB介导的mTOR信号通路蛋白和基因的表达情况。 结果 1母婴分离小鼠行为表现变化及温阳解郁方的调节作用 一般情况及体重变化:空白组小鼠精神状态良好，活动敏捷，毛发光泽柔顺，饮食及大，小便正常，体重正常。模型组小鼠PD5～PD14分离期间出现躁动不安、弹跳的情况，母婴分离结束后烦躁程度明显减弱，体重无明显变化。 行为表现:与空白组比较，模型组小鼠5min内中央区的穿越次数、活动时间及运动路程显著减少（P＜0.05,P＜0.01）;开放臂的运动时间、运动路程及穿越次数显著减少（P＜0.05,P＜0.01）,闭合臂运动时间显著增加（P＜0.01）;第3、4、5天逃避潜伏期显著延长，第一次穿越平台时间显著延长（P＜0.05,P＜0.01）,穿越平台次数、目标象限比例显著降低（P＜0.01）;新颖物体识别比例显著降低（P＜0.05）;说明小鼠出现焦虑抑郁行为和学习记忆障碍;与模型组比较，温阳解郁方中、高剂量和氟西汀组小鼠5min中央区的活动时间和运动路程显著增加（P＜0.05,P＜0.01）;开放臂的运动时间及运动路程显著增加、闭合臂活动时间显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;第4、5天逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05,P＜0.01）,第一次穿越平台时间显著降低（P＜0.01）,穿越平台次数、目标象限停留比例显著增加（P＜0.05,P＜0.01）。 2母婴分离小鼠HPA轴和神经递质的变化及温阳解郁方的调节作用 与空白组比较，模型组小鼠海马NE、5-HT和5-HIAA含量显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,血浆CORT、ACTH的含量有上升趋势（P＞0.05）。与模型组比较，氟西汀组小鼠海马5-HT和5-HIAA含量显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,其余给药组无显著差异（P＞0.05）。 3母婴分离小鼠海马神经发生、突触可塑性的变化及温阳解郁方的调节作用 海马DG区BrdU+/DCX+、BrdU+/NeuN+双标细胞数和PSD95表达密度:与空白组比较，模型组小鼠海马DG区BrdU+/DCX+细胞数显著降低（P＜0.01）,PSD95平均光密度显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，温阳解郁方中、高剂量组及氟西汀组小鼠海马DG区BrdU+/DCX+细胞数显著增加（P＜0.05,P＜0.01）PSD95平均光密度显著增加（P＜0.05,P＜0.01） 4母婴分离小鼠BDNF/TrkB介导的mTOR信号通路的变化及温阳解郁方的调节作用 海马BDNF/TrkB介导的mTOR信号通路表达:与空白组比较，模型组小鼠海马BDNF、p-TrkB、p-Akt、p-mTOR、PSD95及Syn等蛋白表达显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,BDNF、TrkB、Akt、mTOR、PSD95、Syn等mRNA表达显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。与模型组比较，温阳解郁方中、高剂量组和氟西汀组小鼠海马BDNF、p-TrkB、PSD95和Syn的蛋白表达显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,TrkB、mTOR、PSD95的mRNA表达显著增加（P＜0.05,P＜0.01）,温阳解郁方中、高剂量组小鼠海马p-mTOR蛋白表达显著增加（P＜0.05）,温阳解郁方高剂量组p-Akt蛋白表达显著增加（P＜0.05） 5雷帕霉素对温阳解郁方疗效的影响 与温阳解郁方中剂量组比较，雷帕霉素组小鼠5min中央区运动路程显著降低（P＜0.05）;开放臂的运动时间及运动路程显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,闭合臂运动时间显著增加（P＜0.01）;第5天逃避潜伏期显著增加（P＜0.01）,第一次穿越平台时间显著延长（P＜0.01）,穿越平台次数及目标象限停留比例显著降低（P＜0.05,P＜0.01）;海马5-HT含量显著降低（P＜0.05）;DG区BrdU/DCX双标阳性细胞数显著降低（P＜0.05）,PSD95表达密度显著降低（P＜0.05）;海马BDNF、p-mTOR、PSD95、Syn蛋白表达显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,BDNF、mTOR、PSD95、Syn的mRNA表达显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。 结论 温阳解郁方可激活BDNF/TrkB介导的mTOR信号通路，恢复海马神经发生和突触可塑性，改善MS小鼠的焦虑抑郁行为和学习记忆障碍。联合雷帕霉素后中药疗效被抑制，说明温阳解郁方通过激活BDNF/TrkB介导的Akt/mTOR信号通路，改善海马神经发生和突触可塑性，进而缓解MS小鼠的异常行为表现。
NETL