摘要
第一部分Cef改善APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR-STEP61信号的表达和激活 目的： 作为eNMDAR的下游信号，STEP61可以与eNMDAR相互作用。一方面，eNMDAR的激活可促进m-calpain介导的STEP61的切割，导致STEP61表达和活性下调，使p38MAPK的磷酸化增加，活性增强，导致神经元损伤。另一方面，eNMDAR激活介导的STEP61表达和活性下调，可使eNMDAR的GluN2B-Tyr1472位点去磷酸化减弱，磷酸化增强，导致其在细胞膜上的表达增多，加剧eNMDAR的表达和激活，进而形成恶性循环。因此，本部分研究Cef对eNMDAR及其下游信号（包括STEP61和p38MAPK）表达的影响，以及调制STEP61对上述Cef效应的影响，探讨eNMDAR-STEP61通路在Cef改善APP/PS1AD模型小鼠认知障碍中的作用。 方法： 1．Cef对APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR-STEP61信号表达和激活的影响 采用C57BL/6J野生型小鼠和APP/PS1AD模型小鼠、随机分为以下各组，每组5只动物，各组处理如下： （1）野生型（wild-type,WT）组：C57BL/6J野生型小鼠，不做处理。 （2）APP/PS1组：APP/PS1AD小鼠腹腔内注射生理盐水（作为溶剂对照），注射剂量与注射时间与APP/PS1+Cef处理组一样。 （3）APP/PS1+Cef组：APP/PS1AD模型小鼠腹腔内注射用生理盐水配置的Cef溶液（200mg/kg），每天1次，连续注射14天。 各组小鼠在完成上述处理后24h内，异氟烷麻醉下断头分离海马，匀浆后利用密度差速离心法分离突触外组份，应用Westernblot检测各组小鼠突触外GluN2B、GluN2BTyr1472、m-calpain、STEP61、STEP33、磷酸化p38MAPK和p38MAPK的表达。 2．调变STEP61对Cef改善APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR及相关信号表达和活性效应的影响 采用C57BL/6J野生型小鼠和APP/PS1AD模型小鼠，应用AAV-STEP61上调STEP61表达，应用AAV-STEP61-shRNA下调STEP61表达。实验分为以下7组，每组5只动物，各组处理如下: （1）野生型（wild-type,WT）组：C57BL/6J野生型小鼠，不做处理。 （2）APP/PS1组：APP/PS1AD模型小鼠腹腔内注射生理盐水（作为溶剂对照），注射剂量与注射时间与APP/PS1+Cef处理组一样。 （3）APP/PS1+Cef组：APP/PS1AD模型小鼠腹腔内注射用生理盐水配置的Cef溶液（200mg/kg），每天1次，连续注射14天。 （4）APP/PS1+STEP61组：APP/PS1AD模型小鼠侧脑室注射AAV-STEP61，2μL/侧，恢复两周，腹腔内注射生理盐水，注射剂量和注射时间与APP/PS1+Cef处理组一样。 （5）APP/PS1+STEP61+Cef组：APP/PS1AD模型小鼠侧脑室注射AAV-STEP61，2μL/侧，恢复两周，腹腔内注射用生理盐水配置的Cef溶液（200mg/kg），每天1次，连续注射14天。 （6）APP/PS1+shSTEP61组：APP/PS1AD模型小鼠侧脑室注射AAV-STEP61-shRNA，2μL/侧，恢复两周，腹腔内注射生理盐水，注射剂量和注射时间与APP/PS1+Cef处理组一样。 （7）APP/PS1+shSTEP61+Cef组：APP/PS1AD模型小鼠侧脑室注射AAV-STEP61-shRNA，2μL/侧，恢复两周，腹腔内注射用生理盐水配置的Cef溶液（200mg/kg），每天1次，连续注射14天。 各组小鼠在完成上述处理后24h内，异氟烷麻醉下断头分离海马组织，匀浆后利用密度差速离心法分离突触外组份，应用Westernblot检测各组小鼠突触外GluN2B、GluN2BTyr1472、磷酸化p38MAPK和p38MAPK的表达。 结果： 1．Cef减少APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR-STEP61信号的表达和激活 Westernblot结果显示，与wild-type组相比，APP/PS1组海马突触外GluN2B、m-calpain表达增多，STEP61表达减少、STEP33、GluN2BTyr1472和磷酸化p38MAPK表达增多（Plt;0.05）。Cef处理后（APP/PS1+Cef组），海马突触外GluN2B、m-calpain表达减少，STEP61表达增多、STEP33、GluN2BTyr1472和磷酸化p38MAPK表达减少，与APP/PS1组相比（Plt;0.05）。各组间p38MAPK表达无明显差异（Pgt;0.05）。 2．调变STEP61改变Cef改善APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR及相关信号表达和活性的效应 2.1突触外GluN2B和GluN2BTyr1472表达的变化 Westernblot结果显示，与APP/PS1组相比，上调STEP61表达的APP/PS1AD小鼠（APP/PS1+STEP61组）突触外GluN2B的表达有所下降（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef小鼠突触外GluN2B的表达进一步降低（Plt;0.05）。与上调STEP61表达相反，下调STEP61表达，增加了突触外GluN2B的表达，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+shSTEP61小鼠的突触外GluN2B表达上调（Plt;0.05）。同时，下调STEP61还降低了Cef对突触外GluN2B表达的抑制作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组中的突触外GluN2B表达明显上调（Plt;0.05）。 调制STEP61对各组突触外GluN2BTyr1472表达的影响与突触外GluN2B相似。 2.2突触外p38MAPK表达的变化 Westernblot结果显示，突触外磷酸化p38MAPK在APP/PS1+STEP61小鼠中的表达低于APP/PS1AD小鼠（Plt;0.05）。Cef处理后，与APP/PS1+Cef小鼠相比，APP/PS1+STEP61+Cef小鼠突触外磷酸化p38MAPK的表达进一步降低（Plt;0.05）。与上调STEP61表达相反，与APP/PS1AD小鼠相比，APP/PS1+shSTEP61组小鼠突触外磷酸化p38MAPK的表达增加（Plt;0.05）。同时，下调STEP61还降低了Cef对突触外磷酸化p38MAPK表达的抑制作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组中的突触外磷酸化p38MAPK表达明显上调（Plt;0.05）。 调制STEP61对各组突触外p38MAPK的表达无明显影响（Pgt;0.05）。 小结： 1．Cef抑制APP/PS1AD模型小鼠海马eNMDAR-STEP61的表达和激活； 2．上调STEP61增强Cef对APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR表达和突触外p38MAPK激活的抑制作用； 3．下调STEP61减弱Cef对APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR表达和突触外p38MAPK激活的抑制作用。 第二部分Cef改善APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR和突触STEP61表达和激活异常 目的： 淀粉样β蛋白（amyloidβ,Aβ）沉积是AD的标志性病理变化，它可通过上调STEP61表达促进sNMDAR内化，降低ERK1/2磷酸化水平，加剧AD时突触丢失和突触可塑性损害，引起认知障碍。研究发现，Cef可以减轻Aβ的沉积，改善Aβ神经毒性引起的认知障碍。因此，本部分研究Cef对sNMDAR、突触STEP61和ERK1/2表达的影响，以及调节STEP61对上述Cef效应的影响，探讨Cef是否通过改善sNMDAR和突触STEP61的表达和激活异常而发挥改善APP/PS1AD模型小鼠认知障碍的作用。 方法： 1．Cef对APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR和突触STEP61表达和激活的影响 所用实验动物及分组同第一部分1。 各组小鼠在相应处理后24h内，异氟烷麻醉下断头分离海马组织，匀浆后利用密度差速离心法分离突触组份，应用Westernblot检测各组小鼠海马突触STEP61、PSD95、GluN2B、GluN2BTyr1472、磷酸化ERK1/2和ERK1/2的表达。 2．调变STEP61对Cef改善APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR及相关通路表达和激活效应的影响 应用AAV-STEP61上调STEP61表达，应用AAV-STEP61-shRNA下调STEP61表达。所用实验动物及分组同第一部分2。 各组小鼠在相应处理后24h内，异氟烷麻醉下断头分离海马组织，匀浆后利用密度差速离心法分离突触组份，应用Westernblot检测各组小鼠海马突触GluN2B、GluN2BTyr1472、磷酸化ERK1/2和ERK1/2的表达。 结果： 1．Cef增加APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR、PSD95和磷酸化ERK1/2表达、减少突触STEP61表达 Westernblot结果显示，与wild-type组相比，APP/PS1组海马突触GluN2BTyr1472、GluN2B、PSD95、和磷酸化ERK1/2表达减少（Plt;0.05），而STEP61表达增多。与APP/PS1组对比，Cef处理后（APP/PS1+Cef组），海马突触GluN2BTyr1472、GluN2B、PSD95、和磷酸化ERK1/2表达增多（Plt;0.05），STEP61表达减少。各组间ERK1/2表达无明显差异（Pgt;0.05）。 2．调变STEP61改变Cef改善APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR及相关通路表达和激活的效应 2.1突触GluN2B和GluN2BTyr1472表达的变化 Westernblot结果显示，与APP/PS1组相比，APP/PS1+STEP61组海马突触GluN2B表达减少（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组海马突触GluN2B表达进一步减少（Plt;0.05）。与上调STEP61表达相反，下调STEP61后突触GluN2B表达增多，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+shSTEP61组海马突触GluN2B表达增多（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef处理组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组海马突触GluN2B进一步增多（Plt;0.05）。 调制STEP61对各组突触GluN2BTyr1472的表达的影响与突触GluN2B相似。 2.2突触ERK1/2表达的变化 Westernblot结果显示，与APP/PS1组相比，APP/PS1+STEP61组海马突触磷酸化ERK1/2表达减少（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组海马突触磷酸化ERK1/2表达进一步减少（Plt;0.05）。与上调STEP61表达相反，下调STEP61后突触磷酸化ERK1/2表达增多，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+shSTEP61组海马突触磷酸化ERK1/2表达增多（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组海马突触磷酸化ERK1/2进一步增多（Plt;0.05）。 调制STEP61对各组间突触ERK1/2的表达无明显影响（Pgt;0.05）。 小结： 1．Cef增强APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR、PSD95和磷酸化ERK1/2表达，并减弱突触STEP61表达和激活； 2．上调STEP61抑制Cef对APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR表达和突触ERK1/2活化的促进作用； 3．下调STEP61增强Cef对APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR表达和突触ERK1/2活化的促进作用。 第三部分调变STEP61改变Cef对APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害和认知障碍的改善作用 目的： 在第一部分和第二部分研究基础上，本部分研究调变STEP61对Cef改善APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害和认知障碍的影响，以阐明Cef通过改善AD时sNMDAR、eNMDAR和STEP61信号通路的异常发挥改善认知障碍作用的机制。 方法： 1．调变STEP61对Cef改善APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害的影响 所用实验动物、分组及各组处理同第一部分2。各组小鼠在相应处理后24h内，异氟烷麻醉下断头分离海马组织，进行以下内容的观察： （1）突触结构可塑性：高尔基染色观察各组间树突棘密度和树突串珠样改变。 （2）突触传递可塑性：制备海马脑片，观察海马Schaffercollaterals-CA1（SC-CA1）通路长时程增强（Long-termpotentiation,LTP）的变化。 2．调变STEP61对Cef改善APP/PS1AD模型小鼠认知障碍的影响 所用实验动物、分组及各组处理同第一部分2。各组小鼠在相应处理后观察以下内容： （1）新物体识别实验（Novelobjectrecognition,NOR）和新位置识别实验（Novelplacerecognition,NPR）：各组小鼠在注射Cef第8天开始进行新物体识别实验和新位置识别实验，一共3天。测试期间持续给与Cef。 （2）水迷宫实验（Morriswatermaze,MWM）：各组小鼠在注射Cef第11天开始，进行水迷宫实验，共计4天。测试期间持续给与Cef。 结果： 1．调变STEP61改变Cef对APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害的改善作用 1.1树突棘密度和树突珠密度变化 高尔基染色显示，海马CA1、CA3和DG区树突棘密度和树突串珠样变的变化趋势一致。与wild-type组相比，APP/PS1组树突棘密度降低，树突串珠样变增多（Plt;0.05）。与APP/PS1组相比，Cef处理后（APP/PS1+Cef组），树突棘密度增高，树突串珠样变减少（Plt;0.05）。上调STEP61后，一方面加剧APP/PS1AD小鼠树突棘密度降低和树突串珠样改变，同时抑制Cef对AD小鼠树突棘密度降低和树突串珠样改变的改善作用，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+STEP61组的树突棘密度进一步降低，树突串珠样变进一步增多（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组树突棘密度降低，树突串珠样变增多（Plt;0.05）。下调STEP61表达的作用与上调STEP61表达相反，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+shSTEP61组的树突棘密度增高，树突串珠样变减少（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组树突棘密度增高，树突串珠样变减少（Plt;0.05）。 1.2长时程增强变化 各组小鼠输入-输出反应和双脉冲易化无明显差异。与wild-type组相比，APP/PS1组的LTP受损，表现为fEPSP的斜率降低（Plt;0.05）。与APP/PS1组相比，Cef处理显著减轻了APP/PS1组LTP损害，表现为APP/PS1+Cef组fEPSP的斜率大幅度增加（Plt;0.05）。上调STEP61表达未显著加剧对APP/PS1AD小鼠LTP的损害，但有效抑制了Cef对APP/PS1AD小鼠受损LTP的缓解作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组的fEPSP斜率下降（Plt;0.05）。与上调STEP61相反，下调APP/PS1AD小鼠STEP61表达则显著改善了APP/PS1AD小鼠的LTP损害，表现为与APP/PS1组相比，APP/PS1+shSTEP61组的fEPSP斜率有较大的增加（Plt;0.05）；与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+shSTEP61+Cef组的fEPSP的斜率大幅增加（Plt;0.05）。 2．调变STEP61改变Cef对APP/PS1AD模型小鼠认知障碍的改善作用 2.1新物体识别和新位置识别实验结果 与wild-type组相比，APP/PS1组小鼠NOR和NPR认知指数明显降低（Plt;0.05）。与APP/PS1组相比，Cef（APP/PS1+Cef组）明显增加了APP/PS1组小鼠NOR和NPR认知指数（Plt;0.05）。上调STEP61表达（APP/PS1+STEP61组）降低了APP/PS1AD小鼠NOR和NPR认知指数（Plt;0.05），而下调STEP61表达（APP/PS1+shSTEP61组）则增加了APP/PS1AD小鼠NOR和NPR的认知指数（Plt;0.05）。STEP61调制显著影响了Cef对APP/PS1AD小鼠NOR和NPR的认知指数的改善作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组小鼠NOR和NPR认知指数显著降低（Plt;0.05），而APP/PS1+shSTEP61+Cef组小鼠NOR和NPR认知指数进一步升高（Plt;0.05）。 2.1水迷宫实验结果 在定位航行实验中，APP/PS1组小鼠的逃逸潜伏期明显长于wild-type小鼠（Plt;0.05）。与APP/PS1组相比，Cef（APP/PS1+Cef组）显著缩短了APP/PS1组小鼠逃逸潜伏期（Plt;0.05）。与APP/PS1AD小鼠相比，上调STEP61表达进一步增加了APP/PS1AD小鼠（APP/PS1+STEP61组）的逃逸潜伏期（Plt;0.05），而下调STEP61表达缩短了APP/PS1AD小鼠（APP/PS1+shSTEP61组）逃逸潜伏期（Plt;0.05）。STEP61调制显著影响了Cef对APP/PS1AD小鼠逃逸潜伏期的改善作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组的逃逸潜伏期增加（Plt;0.05），而APP/PS1+shSTEP61+Cef组逃逸潜伏期则进一步降低（Plt;0.05）。 在空间探索实验中，与wild-type组相比，APP/PS1AD小鼠目标象限滞留时间和穿越平台次数显著减少。与APP/PS1组相比，Cef处理显著增加了APP/PS1AD小鼠（APP/PS1+Cef组）目标象限滞留时间和穿越平台次数（Plt;0.05）。与APP/PS1组相比，上调STEP61表达进一步减少了APP/PS1AD小鼠（APP/PS1+STEP61组）目标象限滞留时间和穿越平台次数（Plt;0.05），而下调STEP61表达（APP/PS1+shSTEP61组）则增加了目标象限滞留时间和穿越平台次数（Plt;0.05）。STEP61调制还显著影响了Cef对APP/PS1AD小鼠目标象限滞留的时间和穿越平台的次数的改善作用，表现为与APP/PS1+Cef组相比，APP/PS1+STEP61+Cef组小鼠的目标象限滞留的时间和穿越平台的次数显著减少（Plt;0.05），而APP/PS1+shSTEP61+Cef组小鼠的目标象限滞留的时间和穿越平台的次数进一步增加（Plt;0.05）。 小结： 上调STEP61减弱了Cef对APP/PS1AD模型小鼠海马突触结构和传递可塑性损害以及认知障碍的改善作用，下调STEP61增强了Cef对APP/PS1AD模型小鼠海马突触结构和传递可塑性损害以及认知障碍的改善作用。 结论： 1．Cef抑制APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR-STEP61的表达和激活； 2．Cef增强APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR表达，并减弱突触内STEP61表达和激活； 3．上调STEP61增强Cef对APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR及相关信号表达和活性的改善作用，抑制Cef对APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR及相关信号的改善效应，减弱Cef对APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害和认知障碍改善的作用； 4．下调STEP61减弱Cef对APP/PS1AD模型小鼠eNMDAR及相关信号表达和活性的改善作用，增强Cef对APP/PS1AD模型小鼠sNMDAR及相关信号的改善效应，促进Cef对APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害和认知障碍的改善作用。 以上发现表明：Cef通过调控NMDAR-STEP61信号发挥改善APP/PS1AD模型小鼠突触可塑性损害和认知障碍的作用。
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