摘要
甘草作为我国大宗药材，具有补脾益气、清热解毒、调和诸药的功效，素有“十方九草”之说。乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)作为甘草药材的主要来源，黄酮类和三萜类化合物是其主要成分。而人工栽培甘草的质量并不稳定，多数达不到《中华人民共和国药典》(2020版)标准。前人研究表明，适当浓度的脱落酸(abscisicacid,ABA)处理可以显著提高甘草中活性成分的含量，但ABA如何调控甘草活性成分合成的机制尚未阐明。本课题组前期利用Illumina高通量测序技术对不同浓度ABA处理的甘草进行转录组测序，筛选并克隆得到甘草植株中响应ABA的GubZIPs转录因子基因GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33、GubZIP56。 本研究利用甘草毛状根体系筛选出响应ABA的GubZIPs基因，并分析了甘草中GubZIPs基因及活性成分生物合成关键酶基因的时空表达特点;基于甘草基因组克隆并分析甘草活性成分生物合成关键酶基因的启动子，并进一步明确了甘草中GubZIPs基因与活性成分生物合成关键酶基因的具体结合位点。此外构建了GubZIPs基因的原核表达体系，成功获得了可溶性的目的蛋白。主要研究结果如下: 1.GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因在甘草毛状根中对ABA均有显著响应,GubZIP1和GubZIP5均在甘草根部高水平表达,GubZIP1、GubZIP5、GubZIP56基因的表达量随着甘草生长年限的增长而升高。 利用甘草毛状根体系对甘草植株中响应ABA的GubZIPs基因的表达模式进行分析，发现在外源ABA处理下，GubZIP1、GubZIP5、GubZIP33和GubZIP56基因均有显著响应，且在50mg·L-1ABA处理3h条件下这4个GubZIPs基因对ABA的响应最为显著。 GubZIPs基因在不同生长年限的甘草中的表达和主要表达部位具有差异性。实时荧光定量PCR结果表明GubZIP1和GubZIP5均在甘草根部高水平表达，与甘草苷合成通路上的关键酶基因CHS、CHI和甘草酸合成通路上的关键酶基因HMGR、SQS、β-AS、CYP88D6、CYP72A154、GuCSyGT、UGT73P12的表达模式一致，可能为甘草活性成分生物合成通路上的关键调控因子。分析GubZIPs基因在不同生长年限的甘草中的表达发现GubZIP1、GubZIP5、GubZIP56基因与CHI、HMGR、SQS、UGT73P12的表达相一致，均随着甘草生长年限的增长而升高;GubZIP33在二年生甘草中的表达量最高，在一年生和三年生甘草中的表达量无显著差异，与β-AS、CYP88D6、CYP72A154、GuCSyGT的表达规律一致。 2.甘草活性成分生物合成关键酶基因CHS、CHI、SQS、β-AS、GuCSyGT的启动子上含有可与GubZIPs转录因子结合的顺式作用元件。 利用TBtools软件从甘草基因组中提取活性成分生物合成关键酶基因CHS、CHI、HMGR、SQS、β-AS、CYP88D6、CYP72A154、GuCSyGT、UGT73P12的启动子序列。顺式作用元件分析结果显示甘草的9个关键酶基因的启动子上含有大量响应激素或胁迫反应的元件。成功克隆得到CHI、CHS、β-AS、SQS、GuCSyGT、UGT73P12的启动子片段，顺式作用元件分析结果显示除UGT73P12外，其余5个甘草活性成分生物合成关键酶基因启动子区域均含有可与bZIP转录因子结合的顺式作用元件，因此CHS、CHI、SQS、β-AS、GuCSyGT可能是GubZIPs结合的靶基因。 3.GubZIPs转录因子可以通过结合甘草活性成分生物合成关键酶基因上的ABRE元件从而调控基因的表达。 酵母单杂交实验结果表明GubZIP5转录因子可以结合GuCSyGT基因启动子区的第一个ABRE元件(ABRE1),GubZIP33转录因子可以结合β-AS基因和SQS基因启动子区的ABRE元件从而调控基因的表达。GubZIP1和GubZIP56与本实验中CHI_G-box、SQS_ABRE、β-AS_ABRE、GuCSyGT_ABRE1、GuCSyGT_ABRE2均没有结合，可能对CHI、SQS、β-AS、GuCSyGT基因没有直接调控作用。 4.成功构建GubZIPs原核表达体系，获得可溶性的目的蛋白。 构建pET28a-GubZIPs及pET32a-GubZIP56原核表达载体，pET28a-GubZIP1、pET28a-GubZIP5、pET28a-GubZIP33、pET32a-GubZIP56均在Rosetta(DE3)细胞中成功表达并获得可溶性蛋白。其中16℃,110rpm培养10h的条件更有利于pET28a-GubZIP1可溶性重组蛋白的表达，28℃,110rpm培养5h更有利于pET28a-GubZIP5可溶性重组蛋白的表达，pET28a-GubZIP33和pET32a-GubZIP56在16℃和20℃/28℃的培养条件下均能表达出可溶性的目的蛋白。 本研究基于甘草毛状根体系筛选出响应ABA的GubZIPs转录因子，探讨了这些GubZIPs基因和活性成分生物合成关键酶基因在时空表达上的相关性，解析了甘草中响应ABA的GubZIPs转录因子调控活性成分生物合成的分子机制，对进一步构建甘草活性成分生物合成调控网络具有重要意义。
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