摘要
公猪繁殖力的高低直接影响后代的数量、质量以及生产效益,睾丸是雄性哺乳动物主要的生殖器官和内分泌器官，是公猪繁殖力的基础，其基因表达决定着公猪性机能的发育以及精子发生、精子竞争和精卵结合等事件。梅山公猪是世界上多产的品种之一，也是我国优良地方猪品种，具有繁殖力高、性成熟早等特性；而杜洛克公猪是普遍采用的终端父本，生长快、瘦肉率高。本研究利用smallRNA(sRNA)-seq和甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq）技术对20、75、270日龄的杜洛克和梅山公猪睾丸组织的miRNA组和甲基化组进行了分析，并与本课题组前期的mRNA-seq数据进行关联分析。同时，研究了促性腺激素释放激素II型受体（GnRHR2）与其特异性配体GnRH2对公猪睾丸间质细胞睾酮分泌的调控。主要研究结果如下： （1）MeDIP-seq表明杜洛克与梅山公猪甲基化模式相似，其基因内区的甲基化程度高于基因两端，且基因内区和启动子区甲基化水平初情期后降低。品种间，梅山公猪转录起始位点上游2kb的甲基化水平高于杜洛克公猪。 （2）各样品sRNA分类注释表明至少有48%以上的reads被注释为已知miRNA，利用韦恩图筛选到45个差异表达的miRNA。 （3）MeDIP-seq与mRNA-seq关联分析表明转录起始位点附近的甲基化负调控基因表达。GO功能注释表明初情期前后差异比对组中既是差异甲基化又是差异表达的基因参与了有性生殖、雄配子形成及精子发生等生物学过程。DNA甲基化与mRNA及miRNA关联分析表明DNA甲基化和miRNA对睾丸发育过程中基因的表达调控具有重要作用，且随着睾丸的发育，DNA甲基化和miRNA对基因的表达调控是动态变化的。 （4）根据繁殖性状QTL在染色体上的位置，对差异表达基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs）和新转录本在繁殖性状QTL区域进行定位分析，发现在初情期QTL（AGEP）或边界区域的DEGs和差异表达新转录本较多。 （5）利用生物信息学对获得的45个差异表达miRNA进行靶基因预测，并验证了PLCβ1是ssc-mir-423-5p的一个靶基因。mRNA/miRNA负调控对的分析表明品种间75日龄的负调控对明显多于20和270日龄，而品种内20和75日龄梅山公猪负调控对明显多于同时期杜洛克公猪，表明梅山公猪睾丸发育早于杜洛克公猪。 （6）通过免疫组织化学方法对差异表达基因GnRHR2进行细胞定位分析，结果表明GnRHR2广泛定位于睾丸间质细胞和曲细精管中精原细胞和支持细胞，同时在成熟睾丸的精原细胞、精子细胞中也有表达，GnRHR2基因可能参与雄性动物睾酮合成与分泌及性成熟的调控。qRT-PCR和Westernblotting分析表明猪GnRHR2转录本在睾丸组织中高表达。 （7）克隆了差异表达基因GnRHR21851bp的5′端上游调控序列，构建了9个GnRHR2启动子缺失载体并转染细胞，确定了GnRHR2基因启动子主要活性区域。另外，利用生物信息学预测到了2个类固醇生成因子-1（SF-1）结合位点。EMSA和ChIP实验表明转录因子SF-1能够与GnRHR2基因启动子区的第二个位点结合。通过转录因子SF-1与GnRHR2基因相应启动子区域共转染，以及定点突变实验表明转录因子SF-1能够提高GnRHR2启动子活性。超表达和抑制实验证实转录因子SF-1能够上调GnRHR2基因的表达。同时，GnRHR2基因启动子区CpG岛的DNA甲基化分析表明DNA甲基化负调控基因的表达。 （8）通过对GnRHR2与其配体GnRH2对睾丸间质细胞睾酮分泌的调控研究，发现GnRH2能促进GnRHR2基因，尤其是转录本GnRHR2-X1的表达，刺激cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMPresponsiveelementbindingprotein）的磷酸化及与SF-1的互作，调控睾酮合成限速酶StAR（steroidogenicacuteregulatory）的表达，从而调控睾酮的分泌，影响公猪繁殖行为。 总之，本研究获得了较全面的杜洛克与梅山公猪睾丸分子生物学数据（甲基化组、mRNA组和miRNA组），探讨了杜洛克与梅山公猪性机能发育差异及其分子调控机理，并深入研究了SF-1和甲基化对猪GnRHR2的转录调控及GnRHR2不同转录本和GnRH2对睾酮分泌的调控机理。这些结果为解析雄性动物性成熟和精子发生的分子机理以及公猪繁殖力改良奠定了良好基础。
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