摘要
骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是最常见的骨组织恶性肿瘤，严重威胁儿童及青壮年人群的健康。骨肉瘤的转移性生长，特别是肺转移，是骨肉瘤患者死亡的最常见原因。目前，阿霉素骨肉瘤化疗的主要药物之一，然而，它不能有效地抑制骨肉瘤的转移性生长，而且在化疗过程中还具有明显的心脏毒性。目前临床上多推荐药物联合治疗骨肉瘤，因此，寻找一种即能够抑制骨肉瘤生长还能抑制骨肉瘤转移的药物是必要的。人参皂苷Rg3是一种从人参中提取的固醇类化合物，能够在乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌等多种恶性肿瘤中表现出抗癌活性，并且越来越多的研究报道其具有抗肿瘤转移的效果。本研究的目的是确定人参皂苷Rg3和阿霉素在骨肉瘤的体外和体内治疗过程中是否具有协同作用，并进一步探究其抗肿瘤机制。本文的主要研究内容如下所示： 第1章：人参皂苷Rg3联合阿霉素的体内抗肿瘤作用 目的：研究人参皂苷Rg3、阿霉素及两药联合应用的体内抗肿瘤增殖及肺转移的作用。 方法：构建143B荷瘤裸鼠模型，分别评估人参皂苷Rg3、阿霉素及两药联合应用的体内抗骨肉瘤作用；构建143B肺转移裸鼠模型，并采用活体成像法观测注射荧光素钾后的小鼠肺部荧光强度，从而评估人参皂苷Rg3、阿霉素及两药联合应用的体内抗骨肉瘤肺转移作用；HE染色、免疫组化检测肿瘤组织内的Ki67增殖标志物及CD31阳性血管生成的情况。通过监测两种动物模型的体重变化、心脏重量以及观察心脏组织HE染色结果，来观察不同不同给药组对阿霉素心脏毒副作用的影响。 结果：荷瘤小鼠分组给药3周，与对照组相比，人参皂苷Rg3组、阿霉素组以及人参皂苷Rg3和阿霉素联合组的肿瘤抑制率分别为38.5%、57.9%、70.2%。人参皂苷Rg3和阿霉素联合组抑制肿瘤生长效果优于阿霉素组（P＜0.05）。肿瘤组织的HE染色结果可以看出，人参皂苷Rg3联合阿霉素组的坏死和纤维化病灶明显多于其他组。此外，抗增殖标记物ki-67和CD31阳性血管显示，人参皂苷Rg3与阿霉素联合应用减少了肿瘤细胞的增殖（P＜0.05，与阿霉素组相比），以及血管生成（P＜0.05，与人参皂苷Rg3组相比）。 通过体内成像系统（IVIS）监测骨肉瘤在裸鼠体内的转移生长，阿霉素组裸鼠的荧光强度与对照组没有明显差异，人参皂苷Rg3组裸鼠的肺部荧光强度低于对照组（P＜0.05,与对照组相比），人参皂苷Rg3联合阿霉素组的荧光强度最低。离体肺组织的荧光强度与体内成像结果一致。通过观察离体肺组织表面及肺组织的HE染色的结果，人参皂苷Rg3和阿霉素联合组的肺部结节数最少（P＜0.05）。 两种动物模型阿霉素组的裸鼠体重、心脏重量都最低，而人参皂苷Rg3与阿霉素联合组的裸鼠体重比阿霉素组的裸鼠明显改善（P＜0.05,与阿霉素组相比）。这可能是由于人参皂苷Rg3改善了心脏毒性。此外，阿霉素组的心脏HE染色显示心脏组织中有出血灶和大量炎性细胞聚集，人参皂苷Rg3和阿霉素联合组的心脏重量和体积优于单独使用阿霉素（P＜0.05,与阿霉素组相比）。 结论：人参皂苷Rg3与阿霉素联合使用可通过抑制细胞增殖和血管生成来抑制体内肿瘤的生长，抑制骨肉瘤的肺部转移性生长，并且能够改善阿霉素的心脏毒副作用。 第2章：人参皂苷Rg3联合阿霉素的体外抗肿瘤作用 目的：研究人参皂苷Rg3、阿霉素及两药联合应用对人骨肉瘤143B、U2OS及HUVECs细胞增殖、迁移及血管生成的影响。 方法：MTT法检测人参皂苷Rg3联合阿霉素对143B、U2OS和HUVECs细胞的细胞毒性；细胞克隆形成实验检测在骨肉瘤143B和U2OS细胞上的抗肿瘤增殖作用；Transwell实验和划痕实验检测对143B、U2OS和HUVECs细胞细胞迁移的影响；血管形成实验检测不同药物对HUVECs细胞血管形成的影响；WesternBlot实验评估不同EMT相关蛋白质的表达情况。 结果：人参皂苷Rg3、阿霉素均能抑制143B、U2OS和HUVECs细胞的增殖，人参皂苷Rg3联合阿霉素对增殖的抑制效果要明显优于单药组。人参皂苷Rg3不仅能够抑制143B、U2OS和HUVECs细胞的迁移，也能抑制HUVECs细胞的血管生成，阿霉素单独应用对这一过程无明显影响，但是人参皂苷Rg3联合阿霉素对细胞迁移和血管生成的效果优于Rg3单药组。 结论：人参皂苷Rg3联合阿霉素对抑制143B、U2OS和HUVECs细胞的增殖、迁移及血管生成能起到协同治疗的效果。 第3章：人参皂苷Rg3联合阿霉素治疗骨肉瘤的分子机制研究 目的：研究人参皂苷Rg3、阿霉素及两药联合应用的体外抗肿瘤作用的机制。 方法：WesternBlot实验评估相关信号通路蛋白的表达情况。 结果：与对照组相比，人参皂苷Rg3抑制了143B、U2OS和HUVECs细胞中p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、HIF-1α和VEGF蛋白的表达，而AKT、mTOR和p70S6K蛋白的总表达没有变化。虽然阿霉素对细胞中p-AKT、p-mTor、p-p70S6K、HIF-1α和VEGF的表达没有明显影响，但人参皂苷Rg3与阿霉素联合产生的治疗效果比Rg3单独使用更有效。 结论：人参皂苷Rg3通过抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路的表达，能协同阿霉素的抗肿瘤作用。 综上所述，人参皂苷Rg3提高了骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性，明显抑制了细胞增殖、转移和血管生成。从机制上看，人参皂苷Rg3和阿霉素通过调节mTOR/HIF-1α/VEGF和EMT信号通路的协同抗肿瘤活性。此外，人参皂苷Rg3与阿霉素联合使用可抑制多个裸鼠骨肉瘤模型的肿瘤生长和肺转移。同样重要的是，人参皂苷Rg3可以有效地改善阿霉素引起的裸鼠体重下降和心脏毒性。
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