摘要
长春花是一种重要的药用植物，其体内特有的萜类吲哚生物碱（TIAs）具有重要的生理活性和药用价值，如抗肿瘤、抗病毒及治疗高血压和心血管疾病等作用，具有广泛市场需求。由于长春花TIAs结构复杂难以化学合成，因此目前长春花植株仍为主要药源。然而，长春花体内TIAs含量较低，严重制约其开发利用。挖掘参与长春花TIAs合成的新型转录调控因子，阐明TIAs的生物合成调控机制并提高植物体中TIAs的含量具有重要意义。TEOSINTEBRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING（TCP）转录因子在植物生长发育的众多方面发挥至关重要的作用，包括逆境胁迫响应和调控次生代谢产物合成，但是TCP转录基因在长春花中未见报道。为了阐明长春花TIAs的生物合成调控机制，本实验挖掘了响应茉莉酸甲酯（MeJA）诱导上调表达的长春花TCP转录基因CrTCP16和响应紫外线-B（UV-B）胁迫下调表达的CrTCP5，拟构建超量表达载体和抑制表达载体并转化长春花毛状根进行相关功能分析。 主要的研究内容和结果如下： 1、建立长春花毛状根遗传转化体系，考察不同培养基、不同发根农杆菌菌种、不同长春花品种、侵染时长和菌液浓度等对长春花毛状根发根率的影响，筛选出最佳发根诱导条件，建立成熟稳定的毛状根遗传转化体系。结果显示：用长春花（太阳风暴杏色）切除根部的外植体作为侵染材料，发根农杆菌（C58C1）菌液浓度为OD600nm=0.2、侵染时长为20min时诱导发根的效率最高、染菌率最低，且不容易褐化致死，是目前筛选到最佳的毛状根发根诱导方案。 2、构建CrTCP16和CrTCP5的超量表达和干涉表达载体，分别转入长春花毛状根中，通过抗性筛选并利用qRT-PCR对转入基因表达量进行分析，分别获得3个CrTCP16超量表达转基因株系（T16-1、T16-2和T16-3）、3个CrTCP16抑制表达转基因株系（GST16-1、GST16-2和GST16-3）以及3个CrTCP5超量表达转基因株系（T5-1、T5-2和T5-3）。 3、通过对CrTCP16的超量表达和抑制表达转基因株系进行表达分析，发现在超量表达转基因系中，CrSGD、CrSLS、CrDXR、CrCPR、CrSTR、CrD4H、CrTDC、CrIS、CrLAMT和CrDAT等TIAs合成相关基因的表达显著上调，3种TIAs（文多灵、长春质碱和阿吗碱）在超量表达转基因系中含量较野生型均显著上调；在抑制表达系中，大部分与TIAs合成相关的基因表达量显著下调，3种TIAs含量较野生型均显著下降。上述实验结果表明CrTCP16可能正调控长春花TIAs的合成。 4、通过对3个超量表达CrTCP5的转基因系进行分析，发现CrASα、CrTDC、CrSGD、CrCPR、CrDXR、CrIO、CrIS、CrSTR、CrD4H、CrLAMT和CrG10H等与TIAs合成相关的酶基因显著下调；文多灵等3种萜类吲哚生物碱含量显著下降。说明CrTCP5有可能负调控长春花TIAs的合成。 5、克隆CrTCP16和CrTCP5的启动子序列，构建GUS融合表达载体并转化拟南芥，对转基因阳性植株进行GUS染色分析发现：CrTCP16启动子转基因阳性植株主要在叶片表皮毛根部检测到报告基因表达，说明该启动子区段具有核心启动子，且在叶片表皮毛根部有特异性转录；CrTCP5启动子转基因阳性植株主要在叶片表皮毛检测到报告基因表达，说明该启动子区段具有核心启动子，且在叶片表皮毛有特异性转录。 综上所述，本文实验结果表明了CrTCP16和CrTCP5均参与长春花毛状根中TIAs合成和调控作用，并且CrTCP16正调控TIAs合成相关基因转录从而促进多种TIAs合成积累，而CrTCP5负调控TIAs合成相关基因转录从而抑制多种TIAs合成积累。
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