摘要
γ-癸内酯（gamma-decalactone,GDL）系一种桃香馥郁的五元环内酯单体香料，在食品、饮料和化妆品等领域应用甚广。生物转化法因其制备的GDL香气品质佳，绿色环保成为近年来的热门研究方向。该法常以蓖麻油酸（ricinoleicacid，RA）为底物，以天然酵母为菌种。然而，生物转化法制备GDL难以实现工业化生产。本文以提高GDL产量为目标，围绕揭示乳化形成原因、提高底物分散、缓解产物反馈抑制和工艺调控等四个方面开展工作，得到如下结论： 第一，探究生物转化过程乳化形成原因。采用表观-过程分析法，剖析生物转化体系的外观、RA粒径、细胞浓度和蛋白质含量，结果表明酵母粉所含乳化剂、酵母细胞分泌代谢物（如脂肽等）、酵母细胞形成的Pickering效应和搅拌剪切力等因素是乳化形成的综合原因。RA粒径在乳化初期12h达到1353.13±54.06nm，随乳化稳定逐渐小于1μm。乳化在48h前促进底物分散，改变油水比例，增产GDL；而48h后，乳化引起局部GDL浓度过高，强化产物抑制作用，抑制细胞生长。对生物转化过程生产的脂肽进行蛋白质的生物过程分析，检测出106种蛋白质，所含的蛋白质涉及核糖体相关蛋白质、β-氧化过程、应激反应以及细胞壁的保护等内容。脂肽是乳化过程酵母细胞响应体系内酯、氧气和营养物质变化的应激产物。 第二，提高底物分散促进底物摄取。采用埃洛石、黏土、130NP硅石和130H硅石四种材料对底物进行吸附包埋处理，结果表明130H吸附包埋率最佳为70.94±0.27%，其他材料介于40-50%。通过红外，热重和电镜扫描表征表明，吸附材料与底物间存在分子间氢键作用，底物被吸附或包埋而分散，吸附材料成为酵母的固定化载体。通过分析生物过程的pH、细胞浓度、底物和产物变化，结果显示四者pH无显著变化，但黏土由于其特殊结构，受到振荡搅拌形成的机械作用而导致其细胞活力下降。在材料吸附包埋处理后的生物转化体系中，12-36h内GDL浓度持续增加，其生成速率高于对照组。其中，在含有埃洛石的培养基中，36h时GDL转化率最高达到88.99%，而含130H体系内酯浓度最高达到2.79g/L，提高了29.77%。在吸附包埋材料的协助下，生物转化时间缩短，生产能源消耗降低，产物产量得到提高。 第三，原位分离内酯缓解产物反馈抑制。利用树脂吸附内酯，建立固液两相原位分离体系，结果显示DA-201树脂最佳添加量为0.3g/30mL，GDL萃取率高于90%，可减缓产物反馈抑制，与HPD-400可协同提高细胞活力并减缓蛋白质溢出。但GDL产量无显著变化。同时通过添加不同有机溶剂，建立液液原位分离体系作为对比。二苯基聚二甲基硅氧烷、鲸蜡醇乙基己酸酯和辛基十二醇三种溶剂对GDL萃取后，水相内酯残余量少，且细胞能够维持更高的活力。当它们等质量配比混合加入，结果显示10%添加量萃取效果佳、用量少、细胞活力提高。能够减缓产物反馈抑制，提高GDL产量，且连续原位分离比一次效果更显著，缓解细胞蛋白质溢出，增强菌体抗逆性。 第四，对生物转化过程进行工艺调控。通过工艺优化，结果显示正丁醇和正己烷对底物和产物的最佳萃取比例为1:1。高温高压和吐温乳化可提高GDL的萃取效果。通过利用Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计进行配方工艺调控，结果显示当GDL浓度超过2.5g/L时酿酒酵母生长受到抑制。确定优化配方（g/L）：K2HPO47、甘油5、MgSO4·7H2O7、L-肉碱0.1、RA25、吐温803。经过优化底物浓度，结果显示25g/LRA是最佳的底物添加量，能在相对较低的成本保持较高的转化率。在液液原位分离体系中，采用补料培养，可以减缓底物抑制和产物反馈抑制作用，促进酵母细胞增殖，并持续增产GDL。在72h时，GDL产量达到3.71g/L，提高了43.53%。通过转速调控溶氧量，结果表明200rpm是生产GDL的最佳的转速，36h降低转速至150rpm有利于累积GDL，提高了10.64%。 以上研究结果为推进生物转化制备GDL的工业化进程提供了理论基础。在后续研究中，酵母在乳化过程的应激反应可以通过基因表达和代谢通路进一步分析；针对底物处理，寻求更温和的吸附包埋材料以起到底物分散和细胞固定化双重作用；针对产物原位分离，未来将其与数学建模相结合，围绕温度、pH、溶解氧、二氧化碳和菌浓等因素开发出配套设备。最后，将吸附包埋体系、原位分离模型和工艺调控相结合以提高产物产量，为早日实现生物制天然香料GDL的工业化提供技术支持。
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