摘要
MicroRNA（miRNA）是一类内源性的小RNA分子，在植物体中，通过对其靶基因的负调控作用控制植物多项生长发育过程。目前，miRNA调控维管组织发育的机理机制研究已取得一定进展，在拟南芥（ArabidopsisthalianaL.）等物种中已发现多个与植物次生生长相关的miRNA基因。但这些miRNA在维管系统中的具体调控途径尚不清晰，特别是其在木本植物中的作用机制还处于起步阶段。课题组以木本模式植物杨树（PopulustrichocarpaL.）为实验材料，通过smallRNA测序筛选到一系列可能与杨树维管组织发育相关的miRNA，并利用qRT-PCR对候选基因进行再次筛选，本论文对其中的miR164a、miR171d、miR172h、miR390b、miR394a5个候选基因进行实验探究。 采用生物信息学方法，对5个miRNA的基因家族进行分析，采用MEME软件比对不同植物miRNA成熟体序列，验证其在不同植物中的保守性。Themfoldwebserver预测miRNA二级结构，结果表明5个基因的前体均含有多个茎环结构。通过psRobot、psRNATarget共预测到5个miRNA的65个靶基因，根据已发表的miRNA靶基因信息及杨树中的表达数据、降解组数据，结合靶基因结合位点的比对结果，我们最终筛选到19个可能参与杨树维管组织发育的候选靶基因，并对其在维管发育方面的功能进行预测。主要研究结果如下： 以I-69×I-63杂交黑杨为材料，通过5''/3''RACE技术克隆获得了5个miRNA初级转录物全长。使用Gateway方法，完成了5个pri-miRNA过量表达载体的构建；根据其成熟体序列对miR164a、miR171d及miR390b进行小串联模拟靶标的设计，构建STTM过表达载体用来沉默植物体内miR164a、miR171d及miR390b。当前，所有构建均已转化到717杨树，通过抗性筛选，pri-miRNA过表达株系均已得到转化苗，STTM株系尚处于愈伤状态。pri-miR390b及pri-miR394a过表达株系已经完成阳性苗鉴定及qRT-PCR表达量鉴定，获得35S::pri-miR390b过量表达株系15个（2-ΔΔCt≥10），35S::pri-miR394a过量表达株系11个（2-ΔΔCt≥10）。显微观察发现35S::pri-miR171d、35S::pri-miR390b、35S::pri-miR394a株系均存在不同程度的木质部加厚，髓腔减小，韧皮部细胞排列异常的现象。此外，在转化苗的培育过程中，35S::pri-miR390b过表达株系侧根变短。 本研究为进一步探究miRNA基因在杨树维管发育中的功能奠定基础，探究miRNA在维管组织发育中的分子机理与功能对于进一步完善植物miRNA功能注释，探索维管组织发育、木材形成的分子机理具有重要意义。
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