摘要
原始生殖细胞（Primordialgermcells,PGCs）是动物性腺的最早期形态，所以对于PGC特化的研究一直是动物性腺发育研究中的一个非常重要的议题。在哺乳动物中，PRDM14在细胞多能性维持、表观遗传重编程和PGC特化等过程中起着非常重要的调控作用。Prdm14敲除小鼠由于PGC特化受阻而无法形成生殖细胞，进而导致成年小鼠完全不育，但prdm14在低等脊椎动物如鱼类的生殖系统发育中的功能尚未见报道。本研究首先分析了青鳉prdm14的表达模式，在胚胎发育过程中，其从囊胚期开始表达并一直贯穿随后的发育阶段，本实验室之前的研究表明从神经胚以后prdm14一直在早期神经系统中持续表达。此外，prdm14在青鳉的所有成体组织中都有表达，尤其是在性腺中高表达。使用CRISPR/Cas9系统将prdm14敲除后发现，prdm14-/-青鳉的PGC特化、性腺的发育和生殖能力均没有发生异常。但值得注意的是，在孵化酶基因的表达没有显著持续降低的情况下，prdm14-/-青鳉胚胎的出膜时间较野生型胚胎显著推迟。在prdm14-/-青鳉胚胎中，在运动神经元形成和特化中起关键调控作用的isl2a基因的表达量显著下调；在prdm14-/-青鳉胚胎中注射isl2amRNA可以一定程度挽救胚胎出膜变慢的表型，这些结果表明prdm14-/-胚胎出膜时间的延缓可能是由于运动神经元发育不良引起的。此外，启动子转录活性实验表明，在没有prdm14的情况下不同片段长度的isl2a启动子的转录活性均非常微弱；而在prdm14过表达时isl2a启动子的转录活性显著增强，说明prdm14可以调控isl2a的转录活性。综上，在青鳉中，prdm14对性腺发育可能不是必须的，但其却参与了青鳉胚胎早期神经系统发育的调控过程。 基因过表达是研究鱼类基因功能的一个重要手段，通常认为常规转染试剂对鱼类细胞的转染能力较低。重组杆状病毒系统被广泛用作哺乳动物细胞基因转入的有效工具，但其在鱼类细胞中的应用还很少。本研究构建了两个重组杆状病毒系统，该系统含有CMV（cytomegalovirus）和WSSVie1（whitespotsyndromevirusimmediate-earlygene1）两个反向启动子，在两个启动子后面分别带有嘌呤霉素抗性-绿色荧光蛋白（Puromycin-gfp,pf）或者嘌呤霉素抗性-红色荧光蛋白（Puromycin-rfp,pr）融合基因，这个系统可同时实现快速观测、快速滴度测试、药物筛选和外源基因过表达。在本研究中，该重组杆状病毒系统能成功转导多种鱼类细胞，其中包括青鱼（Mylopharyngodonpiceus）鳔细胞（MPB）、青鱼鳍条细胞（MPF）、青鱼肾脏细胞（MPK）、青鳉精原干细胞细胞（SG3）以及斑马鱼早期胚胎成纤维细胞（ZF4）。杆状病毒转导的鱼类细胞在药物筛选后能产生稳定的转基因细胞系，细胞单克隆形成实验证明了转基因MPB细胞的稳定遗传性。此外，本研究还构建了包含pr重组基因和4个鱼类诱导性多能性干细胞（inducedpluripotentstemcell,iPSC）因子的重组杆状病毒BV-pr-OSKM，并将其转入到ZF4细胞中，药筛后这些外源基因能在ZF4细胞中稳定表达，证明了这个系统的可用性。在哺乳动物中，PRDM14参与到细胞多能性核心调控网络中，本研究利用杆状病毒转导和脂质体转染同时将4个鱼类iPSC因子和青鳉prdm14基因转入到鱼类细胞中，实现5个细胞多能性因子的共表达，为鱼类iPSC的研究提供了一定的方法基础。总之，该改造过的重组杆状病毒系统是获得瞬时或稳定转基因鱼类细胞系的有效工具。 综上所述，第一，青鳉中的长链非编码RNAlnc4在调控青鳉两性配子的生成及性腺分泌细胞的合成和分泌功能中起到非常关键的作用。Lnc4及其成熟体miR-202功能的揭示有助于增加对一些人类生殖疾病如唯支持细胞综合征、少精症、卵巢功能低下等致病机理的理解。第二，在低等脊椎动物青鳉中，prdm14可能不参与调控PGC特化和性腺发育过程。在哺乳动物小鼠和硬骨鱼青鳉中，由于其PGC特化方式的不同（外源诱导型、预成型），Prdm14/prdm14的功能也随之发生改变。第三，本研究构建了一个杆状病毒系统，其可以作为鱼类细胞瞬时或者稳定过表达的有效工具。本研究利用该系统将4个鱼类iPSC因子和青鳉prdm14基因同时转入到鱼类细胞中，为鱼类iPSC的研究提供一定的方法基础。
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