摘要
单增李斯特菌是重要的食源性病原菌，可以引起严重的李斯特菌病，是食品安全检测的重点。随着现代分子学技术的快速发展，PCR检测技术具有更高的检测灵敏度和较短的分析时间，PCR和以PCR为基础的检测方法已被广泛用于食品中单增李斯特菌的检测。由于食品中致病性微生物的污染量较少，且食品组分易对检测结果产生干扰，因此在检测前实现对食品中目标病原菌的有效分离和富集是十分必要的。磁性纳米粒子分离具有分离快速、操作简单等特点，将磁性纳米粒子与配体（如抗体、核酸）结合后在外加磁场作用下即可简单快速地从混合物中分离靶标，在特异性捕获靶细菌方面有着良好的应用前景。 本研究通过在磁性纳米粒子（magneticnanoparticles，MNPs）表面涂覆带有氨基官能团的聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）树枝状大分子制备PAMAM-MNPs，通过戊二醛的交联作用在聚合物表面偶联链霉亲和素（streptavidin，SA），利用SA与生物素的特异性结合作用，可在其表面连接上生物素化的单链DNA适配体，制得适配体MNPs（aptamerfunctionalizedmagneticnanoparticles，AP-MNPs），以用于食品中单增李斯特菌的富集，减少食品成分对检测方法的干扰。然后结合多重PCR快速、灵敏地识别食品中对人致病的单增李斯特菌。主要研究内容如下所述。1.PAMAM修饰的Fe3O4MNPs的制备 通过发散法在25℃反应24h合成0.5G至4.0GPAMAM树枝状大分子，选取3.0GPAMAM树枝状大分子包被磁性纳米粒子。之后采用化学共沉淀法合成Fe3O4MNPs，用氨基硅烷和PAMAM树枝状大分子进行表面接枝改性，制备氨基化MNPs（G0MNPs和G3MNPs），进行TEM、FTIR、元素分析、Zeta电位及粒径表征，发现修饰后的粒子分散性良好，带有氨基基团，表面氮含量分别为0.69%、1.10%。两种氨基化MNPs连接SA后吸附生物素化的特异性适配体可制得AP-MNPs，通过竞争性酶联法测得两种SA-MNPs对生物素化适配体的结合容量分别为0.655nmol/mg、1.412nmol/mg。制备的AP-MNPs可用于从混合溶液中分离和富集单增李斯特菌。2.AP-MNPs富集结合多重PCR检测单增李斯特菌 本研究在实验室筛选得到的特异性识别单增李斯特菌的适配体的基础上，基于两者的特异性识别作用，研究功能化MNPs对单增李斯特菌的特异性富集。当AP-MNPs用量为50μg、孵育时间为90min时两种MNPs的捕获效率分别为76.3％±5％和92.6％±2.3％。在菌浓度为2×102CFU/mL-2×108CFU/mL时，AP-G0MNPs和AP-G3MNPs对单增李斯特菌的捕获率分别保持在60%和90%以上，反应体积增大至10mL时捕获效率分别为40.7％±6.4％和81.5％±6.4％，表明AP-G3MNPs在大体积溶液富集中表现出明显的优势。之后，选择iap和hly两对引物分别扩增505bp的李斯特菌属特异性片段和360bp的单增李斯特菌种特异性片段，该多重PCR可以识别对人致病的和非致病的李斯特菌。利用AP-G3MNPs和AP-G0MNPs对污染浓度为2CFU/mL-2×108CFU/mL的牛奶样品进行富集和多重PCR检测，所建立的MNPs富集结合多重PCR技术在单增李斯特菌污染浓度即使低至2CFU/mL时也可被检测到，而未经富集的检测限为2×102CFU/mL。本研究制备的AP-MNPs可以从混合溶液中富集靶标，减少食品基质对检测方法的干扰，提高了多重PCR的检测灵敏度。
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