摘要
目的：观察连花清咳对慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）气道黏液高分泌模型大鼠肺组织炎症和黏液分泌的干预作用，揭示“化痰止咳”治法及其代表方药连花清咳改善气道黏液高分泌的科学内涵，以期为临床治疗AECOPD提供有效干预药物。 方法：采用烟熏联合气道滴注脂多糖（LPS）的方法制备大鼠AECOPD气道黏液高分泌模型，将60只Wistar大鼠随机分为正常组（Control）、模型组（Model）、连花清咳低剂量组（LHQK-L）、连花清咳中剂量组（LHQK-M）、连花清咳高剂量组（LHQK-H）和氨溴索组（Ambroxol），烟熏同时给予相应药物干预，连续12周。观察大鼠一般情况，HE染色观察肺组织病理情况，AB-PAS染色观察气道杯状细胞化生情况，免疫荧光检测肺组织CD45、CD68、CD3、Clara细胞分泌蛋白（CCSP）和黏蛋白5AC（MUC5AC）表达，免疫组化法检测肺组织中MUC5AC、水通道蛋白5（AQP5）蛋白表达，RT-qPCR法检测肺组织MUC5AC、AQP5基因表达，ELISA法测定肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、IL-1β、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和IL-13含量。 结果： 1.一般状况显示，模型建立前，各组大鼠身体健康状况均正常，进食和饮水量正常，行动自如，反应灵敏，毛发光泽，无咳嗽、打喷嚏等呼吸道症状。造模后，模型组大鼠出现咳嗽频繁、气喘加剧、鼻腔内分泌物增多等症状，且伴有明显体重下降、消瘦萎靡，活动量减少，毛发枯槁。经连花清咳和盐酸氨溴索干预后的各组大鼠一般情况均得到了不同程度的改善。其中连花清咳高剂量组大鼠疗效尤为为显著，其咳嗽、打喷嚏等症状较模型组明显减少，进食和饮水增加，体重较模型组有所上升，消瘦等情况改善，毛发有光泽，活动量增加，反应灵敏，精神状态好； 2.HE染色结果显示，正常组大鼠的肺组织镜下结构正常，未见病理性改变；模型组镜下肺泡腔扩张，肺泡壁断裂，细支气管基底膜増厚，肺泡间隔增宽，炎症细胞浸润等组织学损伤；经连花清咳和盐酸氨溴索治疗后，大鼠肺泡结构趋于规则，炎症细胞浸润较模型组减少，以连花清咳中、高剂量组更为明显。肺泡平均截距（MLI）数据显示，与正常组相比，模型组大鼠肺泡显著增大（Plt;0.01），与模型组相比，连花清咳及氨溴索组大鼠肺泡显著减小（Plt;0.05，Plt;0.01）；平均肺泡数（MAN）数据显示，与正常组相比，模型组MAN显著减少（Plt;0.01），与模型组相比，连花清咳和氨溴索组MAN明显增加（Plt;0.01）。氨溴索组MAN数据显著高于连花清咳低剂量组（Plt;0.01），但与连花清咳中剂量组和连花清咳高剂量组比较差异没有统计学意义（Pgt;0.05）； 3.采用免疫荧光染色观察大鼠肺组织CD45、CD68、CD3阳性表达，计算其所标志的白细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞数量。结果显示，与正常组相比，模型组白细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞计数显著增多（Plt;0.01），与模型组相比，连花清咳中、高剂量组和氨溴索组白细胞、巨噬细胞计数显著减少（Plt;0.01），连花清咳高剂量组T淋巴细胞计数显著减少（Plt;0.01）；氨溴索组白细胞、巨噬细胞计数较连花清咳低剂量组明显减少（Plt;0.05，Plt;0.01），白细胞计数较连花清咳高剂量组明显增多（Plt;0.05）； 4.ELISA检测结果显示，与正常组相比，模型组大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、MMP-9和IL-13水平显著升高（Plt;0.01）；与模型组相比，连花清咳中、高剂量组和氨溴索组水平均显著降低（Plt;0.01）；与氨溴索组相比，连花清咳高剂量组TNF-α、IL-1β和IL-13水平显著降低（Plt;0.01），而MMP-9水平无明显降低。 5.AB-PAS染色结果显示，正常组、模型组、LHQK-L组、LHQK-M组、LHQK-H组、氨溴索组大鼠肺组织气道上皮阳性染色面积率分别为0.07±0.03%、4.83±0.58%、3.51±0.57%、1.64±0.33%、1.29±0.29%、1.52±0.27%。模型组阳染面积明显大于正常组（Plt;0.01），提示杯状细胞化生。经连花清咳和氨溴索干预后，模型组的阳性面积显著减小（Plt;0.01）。氨溴索组阳性染色面积较连花清咳低剂量组明显减少（Plt;0.01），但连花清咳中、高剂量组与氨溴索组相比差异没有统计学意义（Pgt;0.05）； 6.采用CCSP和MUC5AC免疫荧光共染评估Clara细胞向杯状细胞的分化情况。与正常组相比，模型组CCSP阳性表达显著减少（Plt;0.01），MUC5AC阳性表达显著增多（Plt;0.01）；与模型组相比，连花清咳中、高剂量组CCSP阳性表达显著增多（Plt;0.01），连花清咳中、高剂量组和氨溴索组MUC5AC阳性表达显著减少（Plt;0.01）；氨溴索组CCSP阳性表达较连花清咳中、高剂量组显著减少（Plt;0.01），MUC5AC阳性表达较连花清咳低剂量组明显减少（Plt;0.05）； 7.肺组织免疫组化结果显示，正常组可见少量MUC5AC阳性表达，与正常组相比，模型组气道上皮细胞中MUC5AC阳性表达明显增多（Plt;0.05），AQP5阳性表达明显减少（Plt;0.05）。经连花清咳与氨溴索治疗后，MUC5AC阳性表达明显减少（Plt;0.05），而AQP5阳性表达明显增多（Plt;0.05），以连花清咳高剂量和氨溴索组较为显著。与氨溴索组相比，连花清咳低剂量组MUC5AC阳性表达明显增多（Plt;0.05），中、高剂量组无显著性差异（Pgt;0.05），连花清咳低剂量组AQP5阳性表达明显减少（Plt;0.05）；中、高剂量组阳性表达明显增多（Plt;0.05）； 8.RT-qPCR结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织MUC5ACmRNA表达明显升高（Plt;0.05），AQP5mRNA表达明显降低（Plt;0.05）；与模型组相比，连花清咳中、高剂量组和氨溴索组MUC5ACmRNA表达均明显降低（Plt;0.05）；连花清咳高剂量组AQP5mRNA表达明显升高（Plt;0.05）； 结论：连花清咳能够通过抑制MUC5AC和促进AQP5的表达维持气道黏液状态平衡，同时通过减少总白细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞数量以及降低BLAF中TNF-α、IL-1β、MMP-9和IL-13等炎症因子和炎症介质水平，减轻肺部炎症，有效改善COPD急性加重期气道黏液高分泌状态，缓解病情。为临床上中医药治疗COPD急性加重期黏液高分泌提供科学依据。
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