摘要
仔猪健康对生猪养殖具有重要意义。然而，仔猪在断奶前后由于免疫力低下，容易受到大肠杆菌等致病菌的感染，造成仔猪腹泻，威胁仔猪健康养殖。因抗菌肽具有调节免疫和肠道微生物的作用，成为仔猪肠道健康的研究热点。本课题组前期研究表明，抗菌肽KR32具有抗菌活性强、细胞毒性低和对益生菌没有明显杀伤作用的特点，对治疗仔猪腹泻具有很好的作用。然而化学合成抗菌肽KR32成本高，难以直接应用于生产实践。应用基因工程生产重组抗菌肽能够有效降低生产成本。本试验利用基因工程技术构建工程菌BacillussubtillisWB800/pBE2R/KR32（WB800_KR32），利用牛津杯法探究其发酵上清对ETEC（EnterotoxigenicEscherichiacoli）K88的抑菌能力，探究工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪肠道抗氧化和屏障功能的影响，最后采用细胞试验探究工程菌WB800_KR32发酵上清对ETECK88感染IPEC-J2细胞抗氧化和屏障功能的影响。主要研究方法与结果如下： 1.工程菌WB800_KR32的构建及抑菌活性检测 利用基因工程技术构建工程菌WB800_KR32，通过牛津杯试验比较不同发酵时间（24~39h）工程菌WB800_KR32上清的抑菌活性，发现33h发酵上清对大肠杆菌（1×106CFU/mL）的抑制能力最强，并且明显强于发酵33hWB800和WB800-pBE2R上清。通过液质联用仪器检测上清中抗菌肽KR32的含量，计算得出工程菌在发酵33h时KR32的表达量为2.24μg/L。 2.工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪肠道抗氧化和屏障功能的作用 选用28头21日龄断奶仔猪（体重7.09±0.25kg），随机分为4组，每组7个重复，每个重复1头猪。试验处理如下：对照组全程每天灌喂10mL0.9％氯化钠；ETEC组在1~14天灌胃10mL0.9％氯化钠，1次/天；ETEC＋WB800组1~14天灌胃10mL5×109CFU/mLWB800，1次/天；ETEC＋WB800_KR32组1~14天灌胃10mL5×109WB800_KR32，1次/天。除对照组外，其余3组15~17天灌胃10mL1×109CFU/mLETECK88，1次/天；第18天采集样品，用于进一步分析。 工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪生长性能的影响：与ETEC组和ETEC＋WB800组相比，灌喂工程菌WB800_KR32能够显著提高仔猪的生长性能，降低腹泻评分（P＜0.05），且与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。 工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪血清和肠道抗氧化功能的影响：与ETEC组相比，灌喂工程菌WB800_KR32能够显著增加血清总抗氧化能力（Totalantioxidantcapacity，T-AOC）（P＜0.05）；显著增加空肠和回肠黏膜谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GPx）活力（P＜0.05），显著降低抗氧化相关基因（GPx、核因子相关因子2(Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）和超氧化物歧化酶1（Superoxidedismutase，SOD）1）的表达（P＜0.05）；显著增加回肠黏膜Nrf2的蛋白表达，同时显著降低kelch样ech关联蛋白1（kelchlikeECHassociatedprotein1，Keap1）的蛋白表达（P＜0.05），并且与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。 工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪肠道屏障功能的影响：（1）工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪物理屏障的影响：与ETEC组相比，灌喂工程菌WB800_KR32能够显著增加空肠和回肠绒毛高度和绒隐比（P＜0.05），显著降低血清中二胺氧化酶（Diamineoxidase，DAO）活力和D-乳酸（D-lacticacid，D-LA）含量（P＜0.05），有上调回肠黏膜闭合蛋白（occludin）的基因（P=0.086）和蛋白（P=0.093）表达的趋势，显著上调胞质紧密粘连蛋白1（Zonulaoccludensprotein1，ZO-1）蛋白表达（P＜0.05）。（2）工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪免疫屏障的影响：与ETEC组相比，灌喂工程菌WB800_KR32能够显著降低血清和小肠黏膜促炎因子IL-6的含量，同时显著增加抑炎因子IL-10的含量（P＜0.05），显著降低NF-κBp65蛋白的磷酸化水平，并且与对照组相比无显著差异。（3）工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪回肠微生物屏障的影响：与对照组相比，ETEC组类消化乳杆菌的丰度显著降低（P＜0.05），而罗姆布茨菌显著增加（P＜0.05）。与ETEC组相比，工程菌WB800_KR32组梭状芽孢杆菌的丰度显著增加（P＜0.05），而大肠杆菌的丰度显著降低（P＜0.05）。 工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪血清代谢的影响：采用GC/LC-MS对仔猪血清代谢物进行分析，差异代谢物主要为天冬酰胺等有机氮化合物以及有机酸和十七烷酸等脂肪酰基。对差异代谢物进行KEGG通路富集分析发现差异代谢物主要富集在谷胱甘肽代谢通路，硒化合物代谢和丙酮酸代谢通路。工程菌WB800_KR32对ETECK88感染仔猪回肠内容物miRNAs的影响：对回肠内容物的RNA进行提取和文库构建，最终的PCR连接产物使用BGISEQ-500平台进行测序。使用RT-qPCR技术对差异表达的miRNAs验证发现，与对照组和工程菌WB800_KR32组相比，novel-ssc-miR1250-5p（miR1250-5p）的表达量在ETEC组中显著升高（P＜0.05）。对miR1250-5p的靶基因进行KEGG分析发现，信号通路主要富集在紧密连接、NF-κB和大肠杆菌感染等信号通路。使用RT-qPCR技术对miR1250-5p的靶基因RelA（NF-κBp65）表达水平进行验证发现，与ETEC组相比，灌喂工程菌组NF-κBp65的基因表达水平显著下调（P＜0.05），并且与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。 3.工程菌WB800_KR32发酵上清对ETECK88感染IPEC-J2细胞抗氧化功能和屏障功能的影响 将6.2×106CFU/mLETECK88处理2h作为ETECK88感染IPEC-J2细胞的条件，细胞存活率为62.53％。与ETEC组相比，40％WB800_KR32发酵上清处理IPEC-J2细胞2.5h后能够显著提高IPEC-J2的细胞活力（P＜0.05）。 工程菌WB800_KR32发酵上清改善ETECK88感染IPEC-J2细胞的抗氧化功能：与ETEC组相比，WB800_KR32发酵上清处理能够显著增加IPEC-J2细胞GPx、CAT和T-AOC活性（P＜0.05），显著增加IPEC-J2细胞Keap1的基因表达（P＜0.05），同时显著降低Nrf2的基因表达（P＜0.05）。 工程菌WB800_KR32发酵上清改善ETECK88感染IPEC-J2细胞的屏障功能：与ETEC组相比，WB800_KR32发酵上清处理能够显著提高occludin和ZO-1的蛋白表达（P＜0.05），显著降低细胞培养基中细胞因子IL-6、IL-10、IL-17和sIgA的含量（P＜0.05）。与WB800发酵上清处理组相比，WB800_KR32发酵上清处理能够显著下调IL-6、IL-8和NF-κBp65的基因表达（P＜0.05）。与ETEC组相比，WB800_KR32发酵上清处理能够显著下调NF-κBp65蛋白磷酸化水平（P＜0.05）。 结论：本试验构建了能够自主分泌具有生物活性的抗菌肽KR32枯草芽孢杆菌体系。工程菌WB800_KR32及其发酵上清能够分别改善仔猪和IPEC-J2细胞的抗氧化能力及肠道屏障功能。其可能是通过抑制miR1250-5p的表达，从而抑制其靶基因NF-κBp65的表达水平，导致其蛋白的磷酸化水平下降，最终降低ETECK88感染导致的炎症反应。本试验为将工程菌WB800_KR32用于调节ETECK88感染导致的肠道氧化损伤和免疫失衡提供了新的视角。
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